王 晗, 湯一鑄, 趙曉亞, 葉 誠, 郭少飛, 羅 靜,熊 露, 曹 維, 吳建安, 王 鵬*

(1. 武漢海關(guān)技術(shù)中心, 湖北 武漢 430050; 2. 湖北省體育科學研究院, 湖北 武漢 430205)

去甲烏藥堿是許多天然植物中存在的β-2激動劑類藥物,具有刺激β-腎上腺素受體、舒張血管的作用,因此在臨床上可被用作強心劑[1-4]。自2017年起,去甲烏藥堿就被國際反興奮劑組織(WADA)列為S3類(β-2激動劑類)違禁物質(zhì),要求不得檢出。去甲烏藥堿主要存在于南天竹、附子、細辛、番荔枝、蓮等天然植物中[5,6],這些植物正是中藥材或日常飲食調(diào)味品的組成部分,此外,其也可能存在于以這些天然藥物作為原料的外用藥物中。因此對日常飲食及所使用的中藥藥物中去甲烏藥堿的檢測有利于避免運動員因誤食誤用而導致的興奮劑陽性檢出。基于此,必須建立針對日常飲食及治療中可能涉及的中藥、調(diào)味品和外敷藥物的高靈敏、可靠的去甲烏藥堿檢測方法。

去甲烏藥堿的常見檢測手段包括液相色譜-紫外光譜法、液相色譜-熒光法[7]、液相色譜-電化學檢測法[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[9,10]等,其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點,已被應用于運動員血清、尿樣[10]以及保健品[9]、中藥[11]中去甲烏藥堿的檢測。

由于中藥、調(diào)味品及外敷藥物的基質(zhì)復雜多樣,去甲烏藥堿在樣品中的存在含量通常較低,且對中藥、調(diào)味品及外敷藥物中去甲烏藥堿需要進行大量的篩查,因此亟須建立快速、靈敏、可批處理的前處理方法對樣品中的去甲烏藥堿進行分析。傳統(tǒng)的樣品前處理方法包括液相萃取技術(shù)和固相萃取技術(shù)等,其中,液相萃取技術(shù)具有操作簡單、萃取速度快的優(yōu)點,但樣品基質(zhì)效應影響嚴重;固相萃取技術(shù)具有萃取材料種類豐富、樣品基質(zhì)效應影響小的優(yōu)點,但操作較為繁瑣。近年來,QuEChERS方法作為一種新型樣品前處理手段獲得了廣泛的關(guān)注,由于其具有操作簡便、可批處理、分析速度快等優(yōu)點,已被廣泛應用于食品[12]、環(huán)境樣品[13]中的農(nóng)藥殘留[14]、獸藥殘留[15]、生物毒素[16]等目標分析物的檢測。

本工作旨在將QuEChERS樣品前處理技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用,建立針對中藥、調(diào)味品及外敷藥物中去甲烏藥堿的簡便、可靠、可批處理、高靈敏檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品、試劑及實際樣品

島津LC-20ADXR型液相色譜儀(Shimadzu,日本), QTRAP6500型串聯(lián)質(zhì)譜儀(SCIEX,美國), MS型分析天平(Mettler Toledo,上海), 2-16PK型低溫離心機(Sigma,德國), SA300型振蕩器(Yamato,日本), MS2型渦旋混合器(IKA,德國), TurboVap LV型氮吹儀(Biotage,瑞典)。去甲烏藥堿(純度99.0%)、非諾特羅(內(nèi)標,純度99.0%)購自天津阿爾塔科技有限公司,甲醇、乙醇、甲酸為色譜純試劑(LiChrosolv, Merck,德國)。QuEChERS吸附劑乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)及石墨化炭黑(GCB)均購自CNW Technology公司(上海)。

本工作建立的方法應用于13種中藥、4種調(diào)味料及1種藏藥貼膏中的去甲烏藥堿含量的檢測,實際樣品包括市售的干荷葉、茯苓、黃芪、當歸、水梔子、杏仁、田七、川芎、白芍、干蓮子、山藥、玉竹、淮山、辣椒、茴香、花椒、桂皮和由湖北省體育科學研究院提供的藏藥骨痛貼膏?？瞻讟悠凡捎檬惺鄣拇竺讟悠?。

1.2 溶液配制

分別稱取去甲烏藥堿和非諾特羅標準品(精確至0.01 mg),配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準溶液,于-18 ℃下避光保存。在實驗過程中精確吸取適量標準溶液用0.1%(v/v)甲酸-乙醇溶液逐級稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

取適量實際樣品,用粉碎機粉碎后過篩備用,粉碎后若不均勻,可用瓷研缽研磨至均勻后過篩備用;藏藥貼膏用剪刀剪開后,取貼膏內(nèi)藥粉。

提取及凈化:取固體樣品約2.0 g(精確至0.001 g)于15 mL離心管中,加入5 mL含0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液、50 μL 1.0 mg/L內(nèi)標(非諾特羅)溶液,渦旋混合均勻后于振蕩器上振蕩提取30 min,離心10 min(8 000 r/min),取上清液1 mL于1.5 mL離心管中;加入50 mg PSA、50 mg C18及7.5 mg GCB,渦旋處理1 min后離心5 min(8 000 r/min),取上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾,濾液供LC-MS/MS測定,若樣品溶液濃度過高,用0.5%(v/v)甲酸-乙醇溶液稀釋后進樣。實驗中所有的樣品均設置3個平行組。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

Waters atlantis T3色譜柱(100 mm×3 mm, 3 μm);流速:0.40 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。流動相:A相為含0.1%(v/v)甲酸的0.5 mmol/L乙酸銨水溶液;B相為含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序如下:0～2.0 min, 5%B; 2.0～2.4 min, 5%B～50%B; 2.4～3.0 min, 50%B; 3.0～3.4 min, 50%B～95%B; 3.4～4.0 min, 95%B; 4.0～4.1 min, 95%B～5%B; 4.1～7.0 min, 5%B。

離子化模式:ESI+;電噴霧電壓(IS): 5 500 V;氣簾氣為241 325 Pa;霧化氣壓力為344 800 Pa;輔助氣壓力為413 700 Pa;檢測方式:多反應監(jiān)測;去甲烏藥堿定性離子對為m/z272.0/255.0、272.0/161.0,定量離子對為m/z272.0/107.0,去簇電壓(DP)為40 V,碰撞能量(CE)分別為20、25、30 eV。內(nèi)標檢測離子對為m/z304.2/135.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件優(yōu)化

將1.0 mg/L去甲烏藥堿溶液以7 μL/min的速度引入質(zhì)譜,分別于正離子模式和負離子模式進行母離子掃描,得到去甲烏藥堿的母離子為m/z272.0;再對母離子進行二級質(zhì)譜分析,選擇豐度較強的3對子離子,其中定量子離子為m/z272.0/107.0,定性子離子為m/z272.0/255.0、272.0/161.0;最后優(yōu)化去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE),最終選擇去簇電壓(DP)為40 V,離子對m/z272.0/255.0、272.0/161.0、272.0/107.0的碰撞能量(CE)分別為20、25、30 eV。內(nèi)標非諾特羅的優(yōu)化同上進行。

去甲烏藥堿色譜檢測條件的優(yōu)化是在文獻[11]的基礎上進行微調(diào)完成的。采用花椒和桂皮混合基質(zhì)提取液加標100 μg/L作為模擬樣品,以檢測離子對m/z272.0/255.0、272.0/161.0、272.0/107.0的色譜分離情況為標準,考察不同流動相梯度洗脫條件下去甲烏藥堿與基質(zhì)的分離情況。結(jié)果表明,按照文獻[11]中的洗脫程序,在從5%B直接提升至95%B的洗脫過程中,混合基質(zhì)提取液中有干擾峰與去甲烏藥堿色譜峰無法基線分離,因此將洗脫程序修改為從5%B提升至50%B后維持0.6 min,再從50%B提升至95%B,最終確定了1.4中的色譜分離條件。

2.2 樣品提取條件的選擇

在樣品提取條件優(yōu)化階段,向空白樣品中加入去甲烏藥堿標準溶液至樣品中去甲烏藥堿含量為20 μg/kg作為模擬樣品。提取條件的選擇以去甲烏藥堿回收率(提取效率)的高低作為判斷標準。去甲烏藥堿是天然植物中存在的芐基異喹啉類生物堿[17],其油水分配系數(shù)(logP)為2.23, 解離常數(shù)(pKa)為9.72,由于其是具有較強極性的生物堿,因此適合采用含酸的極性溶劑進行提取。本工作中首先采用5 mL含有鹽酸的水溶液、甲醇和乙醇作為提取溶劑進行考察,結(jié)果如圖1所示,可知乙醇的提取效率最高。

圖 1 采用不同提取溶劑時去甲烏藥堿的提取效率(n=3)Fig. 1 Extraction efficiencies of higenamine with different extraction solvents (n=3)

此后,采用5 mL含有0、0.1%(v/v)、0.2%(v/v)、0.5%(v/v)、1.0%(v/v)甲酸的乙醇作為提取溶劑,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,去甲烏藥堿的提取效率會隨著甲酸的加入而有所提高,但當甲酸含量達到0.2%(v/v)以后,就基本不再變化,因此在后續(xù)實驗中,采用含0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液作為去甲烏藥堿的提取溶劑。

圖 2 采用含不同體積分數(shù)甲酸的乙醇溶液提取時去甲烏藥堿的提取效率(n=3)Fig. 2 Extraction efficiencies of higenamine with ethanol containing different volume percentages of formic acid (n=3)

由圖1的結(jié)果可知,在處理實際樣品時,提取溶劑的極性會極大地影響去甲烏藥堿的提取,由于水與乙醇可互溶,樣品含水量的不同很可能影響提取體系的極性從而影響去甲烏藥堿的提取效率。以干燥大米樣品為空白基質(zhì),向樣品中加適量蒸餾水模擬含水量為0、20%(質(zhì)量分數(shù))、33%(質(zhì)量分數(shù))和50%(質(zhì)量分數(shù))的實際樣品,采用5 mL含0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液進行提取,考察去甲烏藥堿的提取效率。結(jié)果表明,樣品中含水量的上升會引起去甲烏藥堿提取效率的降低,當樣品不含水時,去甲烏藥堿的提取效率在70%左右,而樣品含水量上升至20%(質(zhì)量分數(shù))時,提取效率就會下降至35%左右?？紤]到中藥和調(diào)味品一般都是干樣,在提取過程中,選擇不水化直接采用含0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液提取。

2.3 其他提取條件的選擇

采用加標空白樣品及花椒樣品比較了在振蕩提取前不浸泡、浸泡0.5 h以及浸泡1 h的提取效率,其提取效率分別為72.8%、68.1%和75.0%,結(jié)果表明浸泡與否對去甲烏藥堿的提取沒有影響,因此在后續(xù)實驗中不浸泡樣品,直接提取。

采用加標空白樣品及花椒樣品考察了振蕩時間20、30、45和60 min的提取效率,結(jié)果表明,振蕩時間對去甲烏藥堿的提取沒有明顯的影響,因此,選擇30 min作為振蕩提取時間。

2.4 QuEChERS凈化條件的選擇

PSA、C18和GCB是QuEChERS凈化過程中常用的凈化劑,為了保證在樣品凈化過程中去甲烏藥堿不會被吸附劑吸附,本工作以加標空白大米樣品中去甲烏藥堿的回收率為考察指標,采用三水平三因素的正交試驗對3種吸附劑的使用量進行了考察,三水平三因素的正交試驗條件及結(jié)果列于表1。由表1可知,3種吸附劑對去甲烏藥堿回收率的影響水平為PSA>C18≈GCB,其中,PSA使用量越高,去甲烏藥堿的回收率越低;而C18和GCB的加入對去甲烏藥堿的回收率幾乎沒有影響;考慮到隨著GCB加入量的增加,可以看到樣品顏色明顯變淺,表明更多色素被吸附劑吸附,但由于GCB為廣譜型吸附劑,當樣品提取液基質(zhì)簡單時,易造成對去甲烏藥堿的吸附,因此在后續(xù)實驗中,采用50 mg PSA、50 mg C18及7.5 mg GCB作為吸附劑對樣品進行凈化。

表 1 正交試驗條件及去甲烏藥堿回收率的結(jié)果(n=3)

2.5 方法分析性能的考察

考慮到實際樣品的基質(zhì)種類復雜,對去甲烏藥堿的提取和凈化會造成較大的影響,因此本工作采用內(nèi)標法對去甲烏藥堿進行檢測。選擇與去甲烏藥堿性質(zhì)相似的動物源性β-2激動劑非諾特羅(logP值為2.06,pKa為9.25)作為內(nèi)標物質(zhì)。

為了驗證內(nèi)標法的必要性,考察了不同樣品的基質(zhì)效應:取3種不同空白樣品(大米、辣椒、水梔子)的提取凈化液加標至去甲烏藥堿質(zhì)量濃度為100 μg/L,取0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液直接配制100 μg/L的去甲烏藥堿溶液,將4份溶液分別引入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,結(jié)果表明相比于以0.5%(v/v)甲酸的乙醇溶液配制的去甲烏藥堿溶液,大米、辣椒和水梔子3種樣品的提取凈化液加標溶液中去甲烏藥堿的峰面積為92.9%、27.7%和18.2%,這表明樣品基質(zhì)的不同對去甲烏藥堿的檢測具有重大影響,因此在本工作中采用內(nèi)標進行定量具有必要性。

在最優(yōu)的實驗條件下,對方法的分析性能進行了考察,方法的檢出限(去甲烏藥堿響應值為噪聲3倍時的含量)為0.03 ng/g,線性范圍為0.10～100 ng/g,線性方程y=0.307 8x-0.002 4(r2=0.993 3)(x為去甲烏藥堿與內(nèi)標含量比,y為去甲烏藥堿與內(nèi)標峰面積比)。方法的精密度為4.33% (0.50 ng/g,n=7),圖3所示為檢出限水平的樣品色譜圖。根據(jù)WADA 2019年對尿液中去甲烏藥堿的檢測限量要求(10 μg/L)[18],本方法具有更高的靈敏度,完全可以滿足運動員日常飲食和外敷用藥中去甲烏藥堿的檢測需求。

圖 3 去甲烏藥堿(0.03 ng/g)和內(nèi)標(25 ng/g)的提取離子色譜圖Fig. 3 Chromatograms of higenamine (0.03 ng/g) and internal standard (25 ng/g)

圖 4 花椒和桂皮樣品及加標樣品中去甲烏藥堿和內(nèi)標的提取離子色譜圖Fig. 4 Chromatograms of higenamine and internal standard in Cassia and Sichuan pepper samples, and their spiked samples

2.6 實際樣品分析及加標回收率的考察

采用所建立的方法對實際樣品中去甲烏藥堿的含量進行了檢測,其中,干荷葉、干蓮子、山藥、玉竹、淮山、花椒、桂皮和藏藥骨痛貼膏中均能檢出去甲烏藥堿,其含量見表2。

表 2 實際樣品中去甲烏藥堿的含量(n=3)

采用加標回收試驗驗證方法的準確性,對花椒、桂皮兩種實際樣品進行加標,其樣品及樣品加標提取離子色譜圖見圖4,加標回收率結(jié)果見表3。由結(jié)果可知,去甲烏藥堿的加標回收率為92.6%～109.8%,表明本方法準確性良好。

表 3 去甲烏藥堿在實際樣品中的加標回收率及RSD(n=3)

3 結(jié)論

本工作建立了基于QuEChERS前處理技術(shù)與LC-MS/MS聯(lián)用檢測去甲烏藥堿的新方法。該方法具有靈敏度高、操作簡便、分析迅速的優(yōu)點,適用于中藥、調(diào)味料和外敷用藥中去甲烏藥堿含量的測定。采用所建立的方法對多種中藥及調(diào)味品進行檢測,在干荷葉、干蓮子、山藥、玉竹、淮山、花椒、桂皮和藏藥骨痛貼膏中檢測到了去甲烏藥堿,采用加標回收試驗驗證方法的準確性,回收率為92.6%～109.8%,表明本方法具有較好的準確性,適用于植物源性食品,特別是中藥、調(diào)味料和外敷用藥中去甲烏藥堿的快速、批量篩查檢測。