李思琦 李春雅 翁夢露 楊 悅 張健翔 劉 進(jìn) 商 瑜 張曉嫣

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875）

0 前言

“轉(zhuǎn)染試劑Vigofect 對 HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方案優(yōu)化”是為生物學(xué)一年級研究生開設(shè)的細(xì)胞及組織培養(yǎng)課程中，學(xué)生做的開放實(shí)驗(yàn)課題。在學(xué)習(xí)了轉(zhuǎn)染技術(shù)基本原理與操作、熒光顯微鏡成像技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)后，學(xué)生綜合運(yùn)用以上技術(shù)，使用轉(zhuǎn)染試劑，對HeLa 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行研究，分析影響轉(zhuǎn)染效率的因素，探究轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化方案，以便為自己今后的實(shí)驗(yàn)工作提供借鑒。同時(shí)，這種問題導(dǎo)向性實(shí)驗(yàn)的設(shè)置，是為培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新性思維，改進(jìn)研究生教學(xué)工作進(jìn)行的探索。

轉(zhuǎn)染是采用除病毒感染外的其他方法將外源核酸（DNA 或者 RNA）人工導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。通過轉(zhuǎn)染能改變細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)，改變細(xì)胞特性，是研究基因或其產(chǎn)物功能和調(diào)控機(jī)制的一種非常重要的技術(shù)手段［1］。將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，例如：DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、顯微注射法及電穿孔法等［2］。

目前常用的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，它們?nèi)菀淄高^細(xì)胞膜，其中陽離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率。但由于陽離子脂質(zhì)體易被血清清除，有高水平毒性，因此陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑被日益廣泛地研發(fā)與使用。陽離子非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑以陽離子聚合物為主要成分，其高度的分支結(jié)構(gòu)確保了正離子電荷的高密度，使與帶有負(fù)電荷的外源基因結(jié)合更有效，容易被細(xì)胞吸收，適合多種類型的細(xì)胞系，可廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染［3］。Vigofect 采用陽離子非脂性物質(zhì)為主的配方，是一種高效真核轉(zhuǎn)染試劑，可與 DNA 形成穩(wěn)定的復(fù)合物，透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并保護(hù) DNA 免受核酸酶的降解。

HeLa 細(xì)胞是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中經(jīng)常使用的一種細(xì)胞，是種源自一位美國婦女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系。HeLa 細(xì)胞是生物學(xué)研究中非常重要的實(shí)驗(yàn)材料，該細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，生長速度較快，易于培養(yǎng)，且較易攝入外源質(zhì)粒 DNA，是檢測轉(zhuǎn)染試劑效果的合宜材料。

轉(zhuǎn)染過程中影響轉(zhuǎn)染效率的因素包括：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度、DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑孵育時(shí)間、培養(yǎng)液體積等。實(shí)驗(yàn)室將長期使用Vigofect 對Hela 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染流程沿用原有方法，未做過轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，希望通過此次實(shí)驗(yàn)，能在質(zhì)粒使用跟細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間上進(jìn)行優(yōu)化，既得到最大轉(zhuǎn)染效率，又能節(jié)省試劑，更合理地安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人子宮頸癌細(xì)胞（HeLa，由北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院商瑜實(shí)驗(yàn)室提供）、GFP 質(zhì)粒、CHIP 過表達(dá)質(zhì)粒（HA-CHIP）。

150 mmol／L NaCl（超純水配制，高壓或過濾滅菌）、Vigofect 轉(zhuǎn)染試劑（威格拉斯）、牛奶（伊利脫脂奶粉配制）、Anti-CHIP（本實(shí)驗(yàn)室保存）、Anti-βactin（Sigma）、山羊抗小鼠 lgG／辣根酶標(biāo)記（中杉金橋）、山羊抗兔 lgG／辣根酶標(biāo)記（中杉金橋）、曝光試劑盒（顯色底物，Thermo Scientific）、DMEM basic（gibco）、PBS（gibco）、胎牛血清 FBS（康源生物）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器（表1）

表1 實(shí)驗(yàn)儀器及來源

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)在含 10%胎牛血清的 DMEM 中（按 1∶1000 加入雙抗），37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率分析 轉(zhuǎn)染前一天鋪細(xì)胞于12 孔板，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天達(dá)到指定匯合度（本實(shí)驗(yàn)中涉及匯合度為40%～100%）。

轉(zhuǎn)染試劑為威格拉斯公司的Vigofect，根據(jù)該公司提供的產(chǎn)品說明步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

配制 Vigofect 工作液，1 μL Vigofect 加入 49 μL 150 mmol/L NaCl 溶液中。輕輕混勻，靜置 5 min。工作體積每孔50 μL。

配制 DNA 工作液，工作體積為每孔50 μL。

將Vigofect 工作液分別逐滴加入DNA 工作液中，混勻后靜置15 min。將混勻后的液體加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中，輕輕混勻，置于 37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2.1 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例對轉(zhuǎn)染效率的影響 轉(zhuǎn)染前一天鋪細(xì)胞于12 孔板，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天達(dá)到匯合度70%。12 孔板中，固定Vigofect用量（1 μL），DNA 轉(zhuǎn)染用量分別為 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。

1.3.2.2 細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響 12 孔板中，轉(zhuǎn)染前一天調(diào)整鋪入皿中的細(xì)胞數(shù)量，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天分別達(dá)到40%、70%、100%的匯合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 用量為 2.5 μg。

1.3.2.3 接種后培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)染效率的影響分別在轉(zhuǎn)染前16 h 及11 h 在12 孔板中鋪入一定數(shù)量 HeLa 細(xì)胞，使兩者細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天分別達(dá)到 70%匯合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA用量為 2.5 μg。

以上轉(zhuǎn)染操作均在轉(zhuǎn)染試劑孵育5 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染36 h 后觀察細(xì)胞，用倒置熒光顯微鏡拍照，每孔細(xì)胞選取3 個(gè)視野，進(jìn)行拍照，通過GFP 熒光表達(dá)量，判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。利用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 Western Blot 檢測

1.3.3.1 收集細(xì)胞樣品 棄掉培養(yǎng)基，每個(gè)孔中加入 500 μL PBS，清洗細(xì)胞，每孔洗 2 遍。每孔中加入 200 μL 2×loading buffer，將細(xì)胞刮下，置于1.5 mL EP 管中，100℃煮 10 min，放入-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 SDS-PAGE 凝膠電泳

1）清洗膠槽，組裝。

2）按照表2 配制分離膠和濃縮膠。

表2 分離膠和濃縮膠的配制

取出制備好的樣品上樣量為10 μL，電泳儀設(shè)定為 140 V 恒壓，30 min，160 V，1 h 30 min，至溴酚藍(lán)跑出膠底邊即可停止電泳。

1.3.3.3 轉(zhuǎn)膜及麗春紅染色 配制轉(zhuǎn)膜緩沖液1 L：100 mL 10×transfer buffer（250 mmol／L Tris-HCl，192 mmol／L甘氨酸 ，ddH2O 中 加 入 30.2 g Tris-HCl，144 g 甘氨酸）+700 mL ddH2O+200 mL無水甲醇。

將PVD 膜置于甲醇中激活5 min。

制作“三明治”轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)：濾紙→膠→PVD 膜→濾紙按順序疊放，在其表層輕輕加transfer buffer。將轉(zhuǎn)膜裝置放入冰水混合物中，轉(zhuǎn)膜2 h。

轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出，浸泡在配制好的麗春紅染色液（2%麗春紅，30%三氯乙酸，30%磺基水楊酸）中，直至條帶顏色完全顯現(xiàn)出來，后轉(zhuǎn)入清水中洗去浮色。

1.3.3.4 裁膜及封閉 裁下β-actin ［相對分子質(zhì)量（Mr）≈4.3×104］作為內(nèi)參，將要檢測的蛋白放在膜的中心位置，將膜剪裁至合適大小并標(biāo)記好所需抗體名稱。放入清水中。

配 制 1 L TBST buffer：900 mL ddH2O 加 入100 mL 10×TBS （5 mol／L NaCl 275 mL，pH＝7.6 的Tris-HCl 100 mL 補(bǔ)齊至1 L）再加入1 mL 吐溫。

配制封閉使用的牛奶（10%）：稱 10 g 奶粉，加 TBST 至 100 mL，攪拌 5～10 min 至溶解。

將洗好的膜按照與封口垂直的方向放入自封袋中，加入配好的牛奶，沒過膜，塑封機(jī)封住開口，37℃ 1 h 或 4℃過夜。

1.3.3.5 孵育一抗、二抗 用牛奶按照1∶1 000的比例配制一抗。封閉結(jié)束后，倒掉牛奶，加入一抗，封膜。4℃過夜或 37℃ 1～2 h。TBST 洗膜 4 遍，每遍5 min。

用 TBST 按照 1∶10 000 的比例配制二抗。將洗膜盒里的TBST 倒干凈，直接在洗膜盒里加入適量二抗，37℃ 1 h 或者室溫 2 h。TBST 洗膜 5遍，每遍 5 min。

1.3.3.6 曝光（化學(xué)發(fā)光儀） 將膜移入化學(xué)發(fā)光儀中。避光配制化學(xué)顯影液。將顯影液滴加到膜上，設(shè)置自動(dòng)曝光參數(shù)（不顯示 marker，曝光 15次），曝光結(jié)束后選擇最合適曝光強(qiáng)度的照片，根據(jù)上樣順序按規(guī)范制作成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖留存。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例對轉(zhuǎn)染效率的影響DNA 轉(zhuǎn)染用量為 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從表達(dá)GFP 細(xì)胞數(shù)目（圖1、表1）和蛋白表達(dá)水平上看（圖2），隨著DNA 對轉(zhuǎn)染試劑比例的增加，轉(zhuǎn)染效率會(huì)逐漸提高，但超過一定限度，隨著DNA 量的增加，轉(zhuǎn)染效率不再提高。這也說明Vigofect 在轉(zhuǎn)染時(shí)存在 DNA 轉(zhuǎn)染量的限制，并不是轉(zhuǎn)染的DNA 量越多轉(zhuǎn)染效率越高。對于該實(shí)驗(yàn)體系，DNA 與 Vigofect 的最佳比例為1 μL Vigofect 轉(zhuǎn)染 2.5 μg DNA。

圖1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞水平觀察

表1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量條件下細(xì)胞熒光數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對轉(zhuǎn)染效率的蛋白水平檢測

2.2 細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響 實(shí)驗(yàn)室原有固定的轉(zhuǎn)染流程都是在細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因此預(yù)測此時(shí)轉(zhuǎn)染效率應(yīng)該最高。但出乎意料的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞密度達(dá)到 40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率最高（圖3、表2、圖4）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室原有流程選擇在70%細(xì)胞匯合度轉(zhuǎn)染是為了削減轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性作用，在保證細(xì)胞處于指數(shù)增長的前提下盡可能獲得更多存活細(xì)胞。此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對HeLa 細(xì)胞利用Vigofect 進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，選用40%的細(xì)胞匯合度其轉(zhuǎn)染效率更高：固定合適的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA 比例后，其細(xì)胞毒性比較?。?0%的細(xì)胞匯合度，細(xì)胞狀態(tài)更好，生長旺盛，攝取外源DNA 的能力也比較強(qiáng)。

圖3 細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響的細(xì)胞水平觀察

表2 不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度條件下細(xì)胞熒光數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖4 細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響的蛋白水平檢測

2.3 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)染效率的影響在孵育之前，通常選擇較高密度接種細(xì)胞，在鋪細(xì)胞后的16 h 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因?yàn)檫@樣細(xì)胞能以比較好的狀態(tài)貼壁生長且進(jìn)入指數(shù)增長期，并通常都能達(dá)到常用的轉(zhuǎn)染匯合度。但16 h 是否是最佳條件并未驗(yàn)證。

在本實(shí)驗(yàn)中為了探討細(xì)胞接種后培養(yǎng)多長時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)染比較好，并能盡量縮短轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，分別選擇了16 h 后轉(zhuǎn)染和11 h 后轉(zhuǎn)染進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。分別于轉(zhuǎn)染前 16 h 及11 h 在12 孔板中鋪入相應(yīng)數(shù)量HeLa 細(xì)胞，使細(xì)胞在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度均達(dá)到 70%左右。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 轉(zhuǎn)染用量 2.5 μg。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，鋪入細(xì)胞11 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率略高于16 h 轉(zhuǎn)染的效率（圖5、表3、圖6）。

圖5 轉(zhuǎn)染時(shí)間對轉(zhuǎn)染效率的影響的細(xì)胞水平觀察

表3 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間條件下細(xì)胞熒光數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖6 轉(zhuǎn)染時(shí)間對轉(zhuǎn)染效率的影響的蛋白水平檢測

3 總結(jié)與評述

學(xué)生所在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常會(huì)用轉(zhuǎn)染技術(shù)研究基因和蛋白的功能及調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室固有流程為細(xì)胞接種后16 h，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA 時(shí)傾向于增加用量，但為什么這樣做，學(xué)生并不清楚。

本次探究實(shí)驗(yàn)針對固有流程，以HeLa 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，通過調(diào)整轉(zhuǎn)染過程中DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞密度等因素，比較不同條件下轉(zhuǎn)染效率的變化，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的條件優(yōu)化的目的。通過之前測試確定，轉(zhuǎn)染試劑孵育時(shí)間，以孵育4～6 h 換液轉(zhuǎn)染效率最佳，因此不再考察。

通過這種探究性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)不一定要按照實(shí)驗(yàn)室的原有經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度一定要達(dá)到70%，轉(zhuǎn)染一定要等接種后16 h。可適當(dāng)降低細(xì)胞密度，適當(dāng)提前轉(zhuǎn)染時(shí)間，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA 的比例。本實(shí)驗(yàn)中用Vigofect 轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞時(shí)最優(yōu)條件為以合適密度接種細(xì)胞后培養(yǎng)11 h 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度在 40%～50%，每孔的質(zhì)粒用量為 2.5 μg。既節(jié)省了時(shí)間、試劑，還提高了轉(zhuǎn)染效率。

通過本次的探究性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生體會(huì)到方法不是一成不變的，需要不斷探索和優(yōu)化。在繁忙的科研活動(dòng)中，偶爾做一次簡單的方法優(yōu)化小實(shí)驗(yàn)，不僅可幫助提高科研效率，而且也為科研生活增添了樂趣。