曹善茂 朱麗潔 聶鴻濤

摘要：采用PCR擴(kuò)增和序列測定等技術(shù)，對巖扇貝（Crassadoma gigantea）線粒體DNA 16S rRNA和CO Ⅰ基因片段進(jìn)行初步研究，得到16S rRNA基因片段的大小在613.0～634.0 bp之間，A、T（U）、G、C的平均含量分別為26.5%、29.7%、24.5%、19.3%;CO Ⅰ基因片段的大小為660 bp，堿基A、T、G、C的平均含量分別為17.2%、40.3%、27.2%、15.3%。16S基因在巖扇貝中偏好使用GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25個(gè)密碼子。COⅠ系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，與巖扇貝親緣關(guān)系最近的是柿孔扇貝（Azumapecten farreri），其次是冰島扇貝（Chlamys islandica）。16S系統(tǒng)進(jìn)化樹親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)依次是北美扇貝（Patinopecten caurinus）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）、Chlamys islandica。

關(guān)鍵詞：巖扇貝;CO Ⅰ基因;16S rRNA;密碼子偏好性;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

中圖分類號： S917.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0028-04

巖扇貝（Crassadoma gigantea）隸屬于軟體動物門、瓣鰓綱、珍珠貝目、扇貝科。原產(chǎn)于北美洲太平洋沿岸海域，廣泛分布于美國的阿拉斯加，加利福尼亞半島以及墨西哥灣附近。該貝具有閉殼肌大、肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，2013年大連海洋大學(xué)科研人員從加拿大溫哥華島引進(jìn)巖扇貝成貝，在遼寧省沿海各地進(jìn)行人工育苗和人工養(yǎng)殖，并對其進(jìn)行了人工育苗技術(shù)和幼貝攝食生理等研究[1-3]。國外學(xué)者對巖扇貝的營養(yǎng)成分、口味、冷藏肉質(zhì)的穩(wěn)定性、野生種群的生長速率、排精產(chǎn)卵機(jī)制、幼貝的餌料配比、附著生理、胚胎發(fā)育等方面進(jìn)行了研究[4-9]。日常巖扇貝通過巖扇貝殼型、顏色等形態(tài)特征進(jìn)行分類，比較而言應(yīng)用分子生物學(xué)的分析方法對巖扇貝的分類及鑒定較少。Bernard建立了包含必須以固著而生的巖扇貝的巖扇貝屬（Crassadoma）[10]。Waller擴(kuò)展了巖扇貝屬的范圍，包含其他固著和非固著的Hinnites種，并創(chuàng)造了包括Caribachlamys屬在內(nèi)的Crassadomini[11]?？梢妿r扇貝在扇貝科下的親緣關(guān)系并不明確，Saavedra等研究了巖扇貝與太平洋部分扇貝和加勒比海扇貝的進(jìn)化關(guān)系[12]。本研究在其基礎(chǔ)上增加國內(nèi)經(jīng)濟(jì)貝類，如櫛孔扇貝、蝦夷扇貝等，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。DNA條形碼是利用足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段構(gòu)建物種的鑒別體系，具有對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的新生物身份識別的優(yōu)勢[13-15]。本研究采用PCR擴(kuò)增和序列測定技術(shù)，對巖扇貝線粒體DNA 16S rRNA和CO Ⅰ基因片段進(jìn)行初步研究，進(jìn)一步證實(shí)巖扇貝在扇貝科中的分類地位及親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

巖扇貝于2016年11月取自遼寧省旅順河口養(yǎng)殖基地，鑒定后活體解剖取扇貝閉殼肌于液氮冷凍后轉(zhuǎn)-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和檢測 隨機(jī)選取巖扇貝2個(gè)，取大約30 mg閉殼肌組織，盡量剪碎，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并溶解于100 μL Tris-EDTA緩沖buffer（TE溶液）中，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度，然后將基因組DNA稀釋至50 ng/μL，4 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序 本試驗(yàn)使用CO Ⅰ和16S引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），所有PCR反應(yīng)均采用預(yù)混合酶試劑（premix），配制 10 μL 體系，在PTC-100型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，16S變性1 min，CO Ⅰ和16S分別48 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán);最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)]純化后，進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本試驗(yàn)選取2個(gè)巖扇貝個(gè)體進(jìn)行測序，所獲原始序列首先與其對應(yīng)峰圖對比檢查，以確認(rèn)序列質(zhì)量;每個(gè)個(gè)體測得正反向序列并用BioEdit軟件進(jìn)行拼接，結(jié)合人工校正;在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對分析，確定序列準(zhǔn)確性。下載扇貝科下物種序列[16]，應(yīng)用MEGA 7軟件檢查平均一致度估測聯(lián)配結(jié)果的可信度;計(jì)算16S的種內(nèi)遺傳距離;基于CO Ⅰ和16S rDNA，應(yīng)用鄰接樹（neighbor joining，簡稱NJ）法分別重建系統(tǒng)發(fā)生樹;運(yùn)用MEGA 7軟件Codonusage功能計(jì)算同義密碼子出現(xiàn)的次數(shù)及使用度[17]，16S基因密碼子偏好性分析，同義密碼子使用度（RSCU）計(jì)算公式為

RSCUij=xijx=xij1ni∑nij=1xij。

式中：xij表示編碼第i個(gè)氨基酸的第j個(gè)密碼子的出現(xiàn)次數(shù);ni表示編碼第i個(gè)氨基酸的同義密碼子數(shù)量（其值為1～6）。當(dāng)密碼子的RSCU值等于1時(shí)，表示該密碼子沒有偏好性;當(dāng)密碼子的RSCU值小于1時(shí)，表示該密碼子使用較少;當(dāng)密碼子的RSCU值大于1時(shí)，表示該密碼子使用較多[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖扇貝CO Ⅰ和16S的DNA序列組成

本研究對巖扇貝的CO Ⅰ和16S基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到清晰的基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后直接進(jìn)行雙向序列測定，經(jīng)過比對和校正后提交GenBank數(shù)據(jù)庫。測序結(jié)果表明，CO Ⅰ 基因片斷大小為660 bp，序列的A、T、G、C平均含量分別為17.2%、40.3%、27.2%、15.3%，其中A+T的含量（57%）明顯高于 G+C的含量（42%）;16S基因片段大小為613.0～634.0 bp（不包含引物），序列A、T（U）、G、C平均含量分別為26.5%、297%、24.5%、19.3%（表2），其中A+T（U）的含量（56.2%）高于G+C的含量（43.8%）。CO Ⅰ和16S堿基均出現(xiàn)偏倚性，符合線粒體堿基組成的特點(diǎn)。將研究中測定及下載的所有16S序列進(jìn)行整理，并裁剪為同一長度529 bp進(jìn)行分析，其保守位點(diǎn)153個(gè)，變異位點(diǎn)369個(gè)，簡約信息位點(diǎn)315個(gè)，單獨(dú)位點(diǎn)54個(gè)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的物種鑒定

本試驗(yàn)選取珍珠貝科馬氏珠母貝、牡蠣科長牡蠣、鶯蛤科白斑珍珠蛤作為外群，在CO Ⅰ和16S進(jìn)化樹中C. gigantea單獨(dú)聚為1支，馬氏珠母貝（Pinctada martensi），白斑珍珠蛤（Pinctada maculata）聚為1支。CO Ⅰ進(jìn)化樹的p-distance<08，16S序列的Jukes-Cantor分析值為0.246，這2個(gè)值分別說明CO Ⅰ和16S所選序列適合構(gòu)建NJ樹。CO Ⅰ的NJ樹表明，C. gigantea進(jìn)化依次接近于櫛孔扇貝（Azumapecten farreri），冰島扇貝（Chlamys islandica），北美扇貝（Patinopecten caurinus），蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis），其中后三者聚為1支（圖1）。16S的NJ樹表明，巖扇貝5個(gè)序列形成具有較高支持度的單分支且依次接近于北美扇貝（Patinopecten caurinus）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）、Chlamys islandica（圖2）。扇貝科的5個(gè)屬，其中類櫛孔扇貝屬的華貴櫛孔扇貝（Mimachlamys nobilis）單獨(dú)聚為1支;海灣扇貝屬的海灣扇貝（Argopecten irradians）、紫扇貝（A. purpuratus）、A. ventricosus聚為1支;櫛孔扇貝屬的C. farreri、A. farreri和S. livida為1支;掌扇貝屬的平瀨掌扇貝（Volachlamys hirasei）、新加坡掌扇貝（V. singaporina）聚為1支;盤扇貝屬的M. yessoensis、P. caurinus聚為1支，聚類結(jié)果基本與傳統(tǒng)的分類結(jié)果一致。

2.3 巖扇貝中16S基因的密碼子偏好性

16S在巖扇貝中擴(kuò)增偏向使用以U或G結(jié)尾的密碼子，總使用度分別為12.76、8.02。其中GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25個(gè)密碼子的RSCU值均大于1，其中GUU的RSCU值大于2，為16S在巖扇貝中偏好性使用次數(shù)最多的（表3）。

3 討論

孔曉瑜等做了櫛孔扇貝和海灣扇貝線粒體16S rRNA基因片段的比較研究，A+T的含量分別為54.73%、55.17%[18]。胡麗萍等在紫扇貝和海灣扇貝中擴(kuò)增16S，獲得基因片段長度均為542 bp，紫扇貝和海灣扇貝的堿基組成 A+T所占比例分別為54.2%、55.1%[19]。朱立靜等對四角蛤蜊CO Ⅰ基因的研究表明，四角蛤蜊的G+C含量明顯低于A+T含量[20];程漢良等對簾蛤目中6種貝類進(jìn)行CO Ⅰ序列的擴(kuò)增結(jié)果也表明，A+T含量明顯高于G+C含量[21]。這與本研究中CO Ⅰ在巖扇貝中的擴(kuò)增結(jié)果相似。一般認(rèn)為，

在線粒體基因組中，16S rRNA基因進(jìn)化速率低，比較保守，而CO Ⅰ基因?yàn)樽儺愋暂^大的區(qū)域，在不少無脊椎動物中檢測到了較大的變異[22-23]。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在剪裁為 529 bp 的16S rRNA片段中，其保守位點(diǎn)153個(gè)，變異位點(diǎn)369個(gè)，變異位點(diǎn)比例達(dá)到69.8%，即巖扇貝種內(nèi)變異率較高，原因可能是16S存在較高的堿基轉(zhuǎn)換和顛換，這部分有待后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步討論。

Thompson等認(rèn)為成對聯(lián)配的氨基酸序列的平均一致性百分比太低時(shí)，多序列聯(lián)配的結(jié)果準(zhǔn)確性會下降，一致性百分比等于1減去p-distance[24]。 當(dāng)p-distance﹤0.8，聯(lián)配結(jié)果是可接受的;當(dāng)p-distance≥0.8則是不可靠的。本試驗(yàn)CO Ⅰ的p-distance為0.746，對應(yīng)的一致性為25.4%，介于20%和30%之間的臨界區(qū)域，氨基酸殘基的聯(lián)配正確率在80%左右，另一項(xiàng)研究表明，氨基酸聯(lián)配的精確性大于50%時(shí)，它對系統(tǒng)進(jìn)化樹準(zhǔn)確性的影響就微乎其微了，即該COⅠ系統(tǒng)進(jìn)化樹是可信且可用的[25]。同理，16S序列的Jukes-Cantor分析值為0.246，說明16S的NJ樹可信且可用。

Saavedr等分析表明，C. gigantea進(jìn)化上接近C. islandica，其次是巖扇貝屬的其他成員如Crassadoma multistriata、Mimachlamys varia[12]。在本試驗(yàn)16S的NJ樹中，C. gigantea更接近P. caurinus和M. yessoensis，其次是C. islandica，在CO Ⅰ的NJ樹中更接近于A. farreri，2個(gè)NJ樹不一致的原因可能是2個(gè)基因片段剪裁序列的長度不同導(dǎo)致聯(lián)配一致度不同。Feng 等研究表明，在CO Ⅰ進(jìn)化樹中芬香海扇蛤（D. plica）、大海扇蛤（P. maximus）、A. pleuronectes、A.irradians聚為1支，在16S進(jìn)化樹中Pecten maximus、Amusium pleuronectes、Argopecten irradians和其他扇貝聚為1支而Decatopecten plica單獨(dú)聚為1支[16]。

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