鐘 良，謝松伯，夏 天，楊鳳丹，聶 婉，梁廣欽，張寶林

(桂林理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 廣西有色金屬及特色材料加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西光電材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004)

1 引 言

超順磁性氧化鐵納米粒子(Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有良好的超順磁性和生物相容性，被廣泛地應(yīng)用于磁共振成像造影劑[1-3]、靶向給藥[4-5]、磁熱療[6]、快速生物分離[7]等領(lǐng)域的研究。針對(duì)于不同的生物應(yīng)用可以對(duì)SPIONs進(jìn)行表面改性和修飾，例如：Huang等[8]研制了半乳糖-終端的氨基官能化SPIONs納米探針，該探針可與肝細(xì)胞表面的脫唾液糖蛋白受體靶向結(jié)合，經(jīng)化學(xué)修飾后的SPIONs納米探針具有肝細(xì)胞靶向作用；Liu等[9]將SPIONs與mRNA c-fos和β-actin鏈互補(bǔ)的單鏈脫氧核苷酸結(jié)合，得到特異性分子探針SPIONs-ODN，能在活體內(nèi)監(jiān)測特定mRNA的轉(zhuǎn)錄過程；Kumar等[10]成功合成涂有脫乙酰殼多糖的SPIONs，并與質(zhì)粒DNA結(jié)合，增強(qiáng)了綠色熒光蛋白的表達(dá)[11]。

聚天冬氨酸(PASP)為聚氨基酸家族中的一類，是一種氨基與第二羧基形成的聚陰離子型多肽[12]，是具有比其它聚合物更穩(wěn)定的較高生物相容性的聚氨基酸[13]。PASP修飾后的SPIONs在血液中的循環(huán)時(shí)間延長[14]，并提高了EPR效應(yīng)(即實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect))[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)PASP包覆修飾有整聯(lián)蛋白(RGD)和大環(huán)螯合劑(DOTA)的SPIONs可以應(yīng)用于靶向腫瘤的研究，具有優(yōu)異的腫瘤靶向性、相對(duì)較長的循環(huán)半衰期和減小肝臟巨噬細(xì)胞吞噬的能力，這歸因于PASP的穩(wěn)定性和抗干擾能力，而PASP包裹的SPIONs在應(yīng)用于MRI造影劑的工作很少有人進(jìn)行研究；陽月等[17]發(fā)現(xiàn)銅鈷錫硫(CCTS)納米晶具有核磁共振成像增強(qiáng)功能；Richard[18]團(tuán)隊(duì)制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe@Fe3O4納米材料，這種核殼結(jié)構(gòu)的納米材料有明顯的造影效果。

一般用于MRI造影劑的粒子以Gd3+、Co2+、Mn2+及其配合物如釓噴酸葡甲胺鹽(Gd-DTPA)為主，這些金屬離子具有順磁性，能通過縮短T1使圖像變亮，為正向造影劑或T1造影劑，應(yīng)用最廣泛的對(duì)比劑是 Gd-DTPA。Ao 等[19]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為載體，成功制備了包裹Gd-DTPA和氟碳?xì)怏w的微泡造影劑，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均實(shí)現(xiàn)了超聲與MRI 的共同顯像。與順磁性物質(zhì)不同，超順磁性材料為負(fù)向造影劑或T2造影劑，其中超順磁性氧化鐵納米粒子是典型的T2造影劑，成分以γ-Fe2O3和Fe2O3為主。超順磁性氧化鐵材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)磁矩大，使用劑量??；(2)Fe2+可以被人體吸收，低毒性，生物相容性高；(3)氧化鐵納米粒子容易進(jìn)行表面修飾，適用于制造分子探針；(4)能在外磁力的吸引下進(jìn)行靶向引導(dǎo)；(5)可以在交變磁場作用下產(chǎn)生熱能，用于腫瘤的磁熱治療。孫陽等[20]成功制備了載有超順磁性氧化鐵高分子的微球，其可用于超聲和MRI的共同造影。李?yuàn)W等[21]成功制備了液態(tài)氟碳納米粒(載有SPIONs)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示超聲和MRI顯像可以有效增強(qiáng)。

高溫?zé)岱纸夥ㄊ侵苽浯判匝趸F納米粒子既簡單又重要的方法之一。由于有機(jī)金屬配合物的不穩(wěn)定性，在加熱、光照和超聲等較溫和的條件下，可分解為金屬或者金屬氧化物，因此這類有機(jī)金屬配合物常常被用作制備SPIONs的前驅(qū)體[22]。通過高沸點(diǎn)的聚合物為溶劑，制備得到單分散性、尺寸和形貌均可控的PEG/PEI-SPIONs，在其基礎(chǔ)上接枝PASP，對(duì)所得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，并對(duì)其在小鼠腦部MRI造影效果進(jìn)行研究及評(píng)價(jià)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

乙酰丙酮鐵(Fe(acac)3, TCL(東京)化成工業(yè)株式會(huì)社)；聚乙二醇(PEG, Mn=1000，汕頭市西隴化工有限公司)；聚乙烯亞胺(PEI, Mn=1800，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；聚天冬氨酸(PASP，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；甲苯、丙酮(汕頭市西隴化工有限公司)。

2.2 材料的合成與制備

取15 g PEG及0.3 g PEI添加入三頸燒瓶中，在磁力攪拌下升溫至 80 ℃，稱取0.7 g Fe(acac)3加入到燒瓶中，此溫度下保溫10 min，并通入氬氣保護(hù)反應(yīng)物不被空氣氧化。保溫結(jié)束后，以7.2 ℃/ min 的升溫速率升溫至260 ℃，保溫60 min后停止加熱，移去熱源冷卻至60 ℃。將冷卻后的產(chǎn)物移入燒杯，并加入60 mL 的甲苯進(jìn)行超聲分散，用磁鐵在燒杯底部進(jìn)行吸附，當(dāng)黑色磁性物質(zhì)基本被吸附至燒杯底部后，棄去上清液，重復(fù)該清洗過程2遍。之后黑色沉淀物再用丙酮清洗2遍，分散于去離子水中，即制得PEI/PEG-SPIONs樣品。將所得到的PEG/PEI-SPIONs分散到40 mL去離子水中，并加入0.2 g PASP，超聲分散直至均勻，然后在50 ℃條件下攪拌60 min，使PASP能夠與PEG/PEI-SPIONs充分反應(yīng)，然后冷卻至室溫，將反應(yīng)后得到的樣品置入透析袋(MW=10000)中，在去離子水中透析5 d，每12 h更換一次去離子水，直到燒杯內(nèi)的去離子水顏色變?yōu)闊o色，將樣品取出，得到PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液，合成工藝流程由圖1所示。

圖1 PEG/PEI/PASP-SPIONs制備的工藝流程Fig.1 The preparation process of PEG/PEI/PASP-SPIONs

3 結(jié)果與討論

3.1 TEM分析

圖2 PEG/PEI/PASP-SPIONs的TEM圖片及粒徑分布圖Fig.2 TEM images with the size distributions of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

圖2為PEG/PEI/PASP-SPIONs的TEM圖片及粒徑分布圖。從圖中可以看出，所制備的納米粒子大小均一，具有較好的分散性[23-25]。量取圖中300個(gè)粒子的粒徑，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算后得到其平均粒徑為(10.8±2.0)nm(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，所合成的納米粒子尺度分布較窄。

3.2 水合動(dòng)力學(xué)粒徑與zeta電位

表1為PEG/PEI/PASP-SPIONs的粒徑、水合動(dòng)力學(xué)粒徑及zeta電位。所制備的PEG/PEI/PASP-SPIONs的水合動(dòng)力學(xué)粒徑平均值為23.4 nm，其值大于TEM的分析結(jié)果10.8±2.0 nm，這是因?yàn)樗蟿?dòng)力學(xué)粒徑代表的不只是SPIONs無機(jī)晶核的大小。由于PEG/PEI/PASP-SPIONs表面包覆有水溶性的修飾物，加上親水性的官能團(tuán)如羥基、羧基，在去離子水中形成吸水的膠團(tuán)，因此水合動(dòng)力學(xué)粒徑會(huì)大于TEM表征結(jié)果。根據(jù)SPIONs的水合動(dòng)力學(xué)粒徑大小對(duì)PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液進(jìn)行穩(wěn)定性研究，將樣品的水分散液放置30 d后測得的水合動(dòng)力學(xué)粒徑平均值為24.2 nm，兩種氧化鐵納米粒子的水合動(dòng)力學(xué)粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯的變化，結(jié)果表明樣品能夠長時(shí)間穩(wěn)定分散在水溶液中。

zeta電位是一個(gè)評(píng)價(jià)膠體分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。SPIONs可以在水中穩(wěn)定分散的主要原因是由于空間位阻效應(yīng)及靜電斥力的作用[26]，利用高溫?zé)岱纸夥ㄋ苽涞腜EG/PEI-SPIONs的zeta電位為35 mV，經(jīng)過接枝了陰離子型的PASP后的PEG/PEI/PASP-SPIONs在去離子水中的分散液的zeta電位為-20.4 mV。PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液具有良好的水分散性及穩(wěn)定性，主要是由于PASP具有良好的水溶性和生物相容性，表面修飾層接枝PASP后同樣可以在去離子水中穩(wěn)定分散。

表1 PEG/PEI/PASP-SPIONs的粒徑、水合動(dòng)力學(xué)粒徑及zeta電位Table 1 The sizes, hydrodynamic sizes and zeta potentials of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

3.3 FT-IR表征

圖3 PEG/PEI-SPIONs(a)、PEG/PEI/PASP-SPIONs(b) 和PASP(c)的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of the PEG/PEI-SPIONs (a), PEG/PEI/PASP-SPIONs (b) and PASP (c)

圖3為 PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs的紅外光譜圖。在1655 cm-1、1621 cm-1處的-COO-基團(tuán)[27]的出現(xiàn)是在高溫條件下PEG的部分羥基被氧化得到的[28-30]，并結(jié)合于氧化鐵納米粒子表面。520 cm-1的吸收峰是氧化鐵的Fe-O的特征吸收峰[31-32]，3423 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是PASP的-NH-與PEG、PEI與PASP之間形成的氫鍵的特征吸收峰[33-34]。3138 cm-1、3014 cm-1處的吸收峰是PEG、PEI和PASP的C-H的特征吸收峰[28,33,35]，1400 cm-1處的吸收峰是PEG、PASP面外彎曲的-OH的特征吸收峰[36]，650 cm-1處的吸收峰是PASP的面內(nèi)彎曲-OH的特征吸收峰[30,37]。根據(jù)上述分析，氧化鐵納米粒子的表面修飾上了PEG、PEI和PASP。

3.4 SPIONs的修飾機(jī)理

圖4為通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析提出的PEG、PEI及PASP共同修飾的SPIONs的表面修飾機(jī)理圖。在利用高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽銹EG/PEI-SPIONs過程中，由于氧化還原反應(yīng)，部分Fe(Ⅲ)被還原成Fe(Ⅱ)，而部分PEG的-OH則是被氧化為-COO-[24]基團(tuán)與SPIONs表面相結(jié)合[38]，而PEI是通過-NH2基團(tuán)結(jié)合于SPIONs表面，另外PEG與PEI之間可能由于氫鍵的作用相互結(jié)合在一起，即PEI中的-NH2與PEG另一端的-OH形成氫鍵，正是由于這些作用力的存在，使得PEG及PEI與SPIONs表面緊緊地相結(jié)合[39]。而PASP與PEG/PEI-SPIONs的接枝是由于PASP上的-OH、COO-與PEG一端的-OH或PEI上的-NH2之間形成氫鍵而相結(jié)合。同時(shí)，PEG、PEI與PASP均具有良好的水分散性，從而給SPIONs提供了一個(gè)良好的水分散穩(wěn)定性前提，這也是制備的PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs能夠在水中長時(shí)間地穩(wěn)定分散的主要原因。

圖4 SPIONs的表面修飾Fig.4 The synthesis and probable coating of the SPIONs

3.5 SPIONs的磁性能及熱重分析

圖5(a)為所制備得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滯回線曲線圖。從圖5(a)可以看出，在300 K下，PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滯回線均經(jīng)過了原點(diǎn)，即樣品的剩磁和矯頑力均為0，結(jié)果表明所制備的PEG/PEI/PASP-SPIONs具有超順磁性。同時(shí)，從圖5(a)中也可以得出，PEG/PEI/PASP-SPIONs的飽和磁化強(qiáng)度分別為30.3 emu/g。圖5(b)表示的是PEG/PEI/PASP-SPIONs的25～800 ℃熱重曲線，由圖5(b)中可以得出，PEG/PEI/PASP-SPIONs總的失重率為33.7%。圖5(a)中的PEG/PEI/PASP-SPIONs的飽和磁化強(qiáng)度與PEG/PEI-SPIONs[39]的相差較大，這是由于PEG/PEI-SPIONs與PEG/PEI/PASP-SPIONs表面的有機(jī)物修飾層的百分含量不同所導(dǎo)致測定的結(jié)果產(chǎn)生的差別，由上述結(jié)果可以計(jì)算出純的SPIONs的飽和磁化強(qiáng)度為89.9 emu/g，與計(jì)算得到的PEG/PEI-SPIONs的純的SPIONs的飽和磁化強(qiáng)度(85.0 emu/g)相差不大，SPIONs表面的有機(jī)物修飾層種類及數(shù)量對(duì)純的SPIONs的飽和磁化強(qiáng)度影響不大。這些結(jié)果表明SPIONs在修飾PEG、PEI和PASP后仍然具有較高的飽和磁化強(qiáng)度。

圖5 PEG/PEI/PASP-SPIONs的磁滯回線(a)和25～800 ℃熱重曲線(b)Fig.5 Hysteresis loop at room temperature (a) of the PEG/PEI/PASP-SPIONs and TGA curve from 25-800 ℃(b)

3.6 SPIONs在小鼠腦部磁共振成像

為了研究PEG/PEI/PASP-SPIONs作為磁共振造影劑的效果，采用Bruker 7 T磁共振成像儀對(duì)昆明小鼠進(jìn)行腦部磁共振成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測試參數(shù)為：視野=1.8 cm×1.8 cm，矩陣=256×256，層厚=1 mm，回波時(shí)間=4 ms、11 ms、18 ms、25 ms、32 ms、39 ms、46 ms、53 ms、60 ms、67 ms、74 ms、81 ms，重復(fù)時(shí)間=1500 ms，分別對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射100 μL PEG/PEI/PASP-SPIONs(濃度均為2.5 mg/kg Fe)。圖6(a1)～(a7)為注射PEG/PEI/PASP-SPIONs前后小鼠腦部磁共振成像圖，圖6(a1)分別為未注射PEG/PEI/PASP-SPIONs前小鼠腦部T2*磁共振掃描圖，圖6(a2)～(a7)分別是注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 5 min、10 min、30 min、1 h、4 h及24 h后的T2*磁共振掃描圖。圖6(b)～(f)分別為小鼠尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h后嗅球、前額葉皮層、大腦皮層、丘腦和腦干的T2*值變化柱狀圖。

由圖6(a)可以看出，尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs后小鼠腦部組織的T2*加權(quán)磁共振成像呈現(xiàn)整體灰度增加，其灰度都是先增加后降低，進(jìn)行尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs的小鼠的腦部磁共振成像圖像在注射5 min后圖6(a2)就達(dá)到灰度的最大值，而進(jìn)行尾靜脈注射PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的小鼠的腦部磁共振成像圖像在注射30 min后達(dá)到灰度的最大值，這可能是由于PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的水分散液的zeta電位值分別為35.0 mV、19.0 mV，而PEG/PEI/PASP-SPIONs的水分散液的zeta電位值則是-20.4 mV，可以質(zhì)子化的PEI能夠與表面呈現(xiàn)負(fù)電性的細(xì)胞膜之間相互作用，部分PEG/PEI-SPIONs可能會(huì)短時(shí)間滯留細(xì)胞膜表面，在修飾了PASP后，聚陰離子型的PASP可以減弱PEI與表面呈現(xiàn)負(fù)電性的細(xì)胞膜之間相互作用，并加快了PEG/PEI/PASP-SPIONs在血液中循環(huán)速率，以致注射了PEG/PEI/PASP-SPIONs的小鼠的腦部磁共振成像的造影達(dá)到顯著的效果的時(shí)間比注射PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的短，并且APSP具有低毒性和良好的生物相容性[1]。與測量分析得到T2*值圖6(b)～(f)在小鼠腦部不同區(qū)域的變化相一致，表明所合成的PEG/PEI/PASP-SPIONs都能夠縮短質(zhì)子的T2弛豫時(shí)間，增強(qiáng)組織成像對(duì)比度。根據(jù)圖6(b)、(c)可以看出，在注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 5 min后在嗅球及大腦皮層的T2*值變化程度比PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的高，而在小鼠的腦干部位尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs(圖6(f))與PEG/PEI-SPIONs、PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]的T2*值變化程度則是相反的，這可能是由于腦部不同的區(qū)域?qū)EG/PEI-SPIONs、PEG/PEI/Tween 80-SPIONs和PEG/PEI/PASP-SPIONs的滯留的作用效果不一致造成的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PEG/PEI/PASP-SPIONs的造影效果在尾靜脈注射5 min后達(dá)到最佳的效果。而由圖6(b)～(f)可以看出在尾靜脈注射24 h后T2*值在腦部不同區(qū)域均有不同程度的降低，但與PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs[40]相比較，PEG/PEI/PASP-SPIONs的T2*值降低程度大，這是由于修飾了聚陰離子型PASP的SPIONs可以在血液快速運(yùn)送，最終大部分被小鼠的肝臟所吸收。其結(jié)果表明PEG/PEI/PASP-SPIONs可以長時(shí)間在小鼠腦部具有MRI成像效果，但PEG/PEI/PASP-SPIONs在小鼠腦部的成像時(shí)間比PEG/PEI-SPIONs和PEG/PEI/Tween 80-SPIONs的成像時(shí)間更短。在實(shí)驗(yàn)過程中，所述小鼠都可以進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，表明PEG/PEI/PASP-SPIONs的良好的生物兼容性。

圖6 小鼠尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs(a1-a7) 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h 后小鼠腦部磁共振成像圖，小鼠尾靜脈注射PEG/PEI/PASP-SPIONs 0 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、24 h 后嗅球(b)、前額葉皮層(c)、大腦皮層(d)、丘腦(e)和腦干(f)的T2*值變化柱狀圖Fig.6 T2*-weighted MR images of the KM mouse brains pre-injection and 5 min, 10 min, 30 min, 1 h, 4 h, 24 h after intravenous injection of the PEG/PEI/PASP-SPIONs (a1-a7), relative T2* value of bulbus olfactorius (b), frontal cortex (c), temporal (d), thalamus (e) and brain stem (f) extracted from T2*-weighted MR images of KM mouse brains pre-injection, 5 min, 10 min, 30 min, 1 h, 4 h and 24 h after the intravenous injection of the PEG/PEI/PASP-SPIONs

4 結(jié) 論

以PEG為反應(yīng)溶劑，PEI為添加劑，利用高溫?zé)岱纸夥ê铣傻玫絇EG與PEI共同修飾的PEG/PEI-SPIONs，再與PASP進(jìn)行接枝，得到PEG、PEI及PASP共同修飾的PEG/PEI/PASP-SPIONs，結(jié)論如下：

(1)成功制備得到了PEG/PEI/PASP-SPIONs，其具有粒子尺寸均一和良好的穩(wěn)定性及分散性的特點(diǎn)；

(2)通過對(duì)KM小鼠進(jìn)行尾靜脈注射所制備得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs，并觀察小鼠腦部的磁共振成像的情況，結(jié)果表明，所制備得到的PEG/PEI/PASP-SPIONs具有良好的造影效果，因此PEG/PEI/PASP-SPIONs可以用作磁共振成像造影劑。