貓杯狀病毒抗體間接ELISA 檢測方法的建立

孟凱聞,朱文壯,張 迪,金藝鵬,林德貴,孟 賡

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀100193)

貓杯狀病毒(FCV)是貓科動物的常見病原,可通過口、鼻等途徑感染,主要在口腔和呼吸道組織中增殖,FCV 的單獨感染或與其他病原的混合感染可引起貓的上呼吸道和口腔病變,臨床見打噴嚏、眼鼻部出血、結(jié)膜炎、口炎、牙齦炎、口腔潰瘍,嚴(yán)重者還會發(fā)生肺炎、跛行、流產(chǎn)、慢性胃腸炎、皮膚水腫及潰瘍等[1-3]。其中貓口炎是臨床中的常見口腔疾病,已有很多外國的報道揭示了貓口炎與FCV 的高度關(guān)聯(lián)性,近年在北京地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查也證明了這一點[4-7]。FCV 與貓皰疹病毒等感染引起的癥狀非常相似,也可引起很多復(fù)雜的非典型癥狀,單從臨床癥狀難以確診病原,還需結(jié)合實驗室診斷確診。目前針對FCV 的實驗室診斷包括病毒分離、核酸檢測和血清學(xué)檢測。本研究將原核表達(dá)的FCV-VP1 蛋白作為包被抗原,建立檢測血清中FCV 抗體的間接ELISA 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒、細(xì)胞、血清及試劑 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-FCV-VP1;感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3);96份臨床血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院、美聯(lián)眾合伴侶動物醫(yī)院、北京思誠動物醫(yī)院、北京健愛緣動物醫(yī)院、北京和諧動物醫(yī)院、北京天照愛寵動物醫(yī)院、北京星輝動物醫(yī)院提供,由本實驗室-80 ℃保存;HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 購自北京博爾西科技有限公司。

1.2 FCV-VP1 抗原的制備 按常規(guī)方法將構(gòu)建的FCV-VP1 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3);將重組表達(dá)菌株37 ℃培養(yǎng),并用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),將表達(dá)的重組蛋白利用HisTrap HP 親和柱純化。

1.3 間接ELISA 條件優(yōu)化 基本步驟如下:將純化的FCV-VP1 重組蛋白1 μg/mL 4 ℃過夜包被96孔酶標(biāo)板,PBST 洗板3 次,加封閉液37 ℃封閉2 h,PBST 洗板3 次;加入血清稀釋液100 倍稀釋的待檢血清,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,加入酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋的HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,每孔加入100 μL TMB 底物溶液37 ℃顯色10 min,用50 μL 2 mol/L 的硫酸終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計算陽性與陰性血清OD450nm值之比(P/N)。應(yīng)用棋盤法確定各最佳條件。

1.3.1 最佳封閉液的確定以1 μg/mL 的抗原濃度,100 μL/孔包被96 孔酶標(biāo)板,分別以1%BSA、0.05%OVA、1%明膠、5%胎牛血清、5%脫脂奶粉作封閉液,37 ℃封閉2 h,FCV 陽性血清作為一抗,同時設(shè)置陰性對照,加入HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測,酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計算P/N 值,確定最佳封閉液。

1.3.2 最佳血清稀釋液的確定將樣本血清分別以1%BSA、PBST、5%兔血請、5%胎牛血清按1∶100 稀釋,100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板反應(yīng),進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測,酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計算P/N值,確定最佳血清稀釋液。

1.3.3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定將HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 以1%BSA、PBST、5%兔血請、5%胎牛血清稀釋至效價為1∶10 000,進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測,酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計算P/N 值,確定最佳酶標(biāo)二抗稀釋液。

1.3.4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價的確定以篩選的最佳酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 至效價為1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,設(shè)置2 個重復(fù),進(jìn)行常規(guī)ELISA 檢測,酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值,計算P/N 值,確定最佳酶標(biāo)二抗工作效價。

1.3.5 臨界值的確定對本實驗室保存的32 份FCV陰性血清樣本,以本實驗室建立的間接ELISA 抗體檢測方法進(jìn)行檢測,計算樣本OD450nm值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計學(xué),當(dāng)樣本OD450nm值≥X+3SD 時,判定為陽性。

1.4 間接ELISA 方法的特異性 按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 檢測板對FCV 陽性血清及貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline Panleukopenia Virus,FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritionitis Virus,FIPV)、貓白血病病毒(Feline Leukemia Virus,FeLV)、貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodefiency Virus,FIV)的陽性血清進(jìn)行特異性檢測。

1.5 間接ELISA 方法的重復(fù)性 批內(nèi)重復(fù)性試驗:按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 檢測板測定8 份FCV 陽性血清,每份血清做3 孔平行,對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,評估間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批間重復(fù)性試驗:應(yīng)用3 個不同批次制備的ELISA 檢測板,測定8 份FCV 陽性血清,對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,評估間接ELISA 方法的批間重復(fù)性。

1.6 臨床貓血清的檢測結(jié)果 按照上述建立的ELISA 方法,對96 份臨床收集的貓血清進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 最佳封閉液的確定 以純化的重組蛋白FCVVP1 1 μg/mL 4 ℃過夜包被酶標(biāo)板,分別以1%BSA、0.05%OVA、1%明膠、5%胎牛血清、5%脫脂奶粉作封閉液,進(jìn)行ELISA 檢測,結(jié)果顯示(表1),當(dāng)用5%脫脂奶粉封閉時,P/N 值最高,因此選擇5%脫脂奶粉為最佳封閉液。

2.2 最佳血清稀釋液的確定 將樣本血清分別以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清按1∶100 稀釋,進(jìn)行ELISA 檢測,結(jié)果顯示(表2),當(dāng)用5%胎牛血清稀釋時,P/N 值最高,因此選擇5%胎牛血清為最佳血清稀釋液。

2.3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定 以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清分別稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG,進(jìn)行ELISA 檢測,結(jié)果顯示(表3),當(dāng)用5%兔血清作為酶標(biāo)二抗稀釋液時,P/N值最高,因此選擇5%兔血清為最佳酶標(biāo)二抗稀釋液。

2.4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價的確定 以5%兔血清稀釋HRP 標(biāo)記兔抗貓IgG 至效價為1 ∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,進(jìn)行ELISA 檢測,結(jié)果顯示(表4),當(dāng)效價為1 ∶20 000 時P/N 值最高,因此選擇1∶20 000為最佳酶標(biāo)二抗工作效價。

2.5 臨界值的確定 對本實驗室保存的32 份FCV陰性血清樣本,進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示(見表5),樣本OD450nm值的平均值()為0.068,標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.031,因此臨界值為+3SD=0.161,即當(dāng)樣本OD450nm值≥0.161 時判為陽性。

2.6 間接ELISA 方法的特異性 用上述建立的間接ELISA 方法分別對FPV、FIPV、FeLV、FIV 和FCV的陽性血清進(jìn)行測定,其OD450nm值分別為0.096、0.103、0.074、0.105、1.189,除FCV 陽性血清外,其他病毒的陽性血清OD450nm值均小于臨界值0.161,表明建立的間接ELISA 方法特異性良好。

2.7 間接ELISA 方法的重復(fù)性 重復(fù)性試驗表明,批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)均值為4.33%(表6),批間重復(fù)實驗變異系數(shù)均值為5.75%(表7)。通過試驗表明,建立的間接ELISA 方法重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

2.8 臨床貓血清的檢測結(jié)果 用本實驗室建立的檢測方法對96 份臨床收集的貓血清進(jìn)行檢測,ELISA 檢測結(jié)果表明(表8),全部血清樣本中共檢測出40 份陽性血清,貓口炎就診病例陽性率為96.3%(26/27),貓口炎無關(guān)病例陽性率20.3%(14/69)。

表1 最佳封閉液的確定

表2 最佳血清稀釋液的確定

表3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋液的確定

表4 最佳酶標(biāo)二抗工作效價的確定

表5 臨界值的確定

表6 間接ELISA 批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果

表7 間接ELISA 批間重復(fù)試驗結(jié)果

表8 臨床血清樣本的檢測結(jié)果

3 討論

FCV 在臨床上可引起貓科動物口炎,導(dǎo)致患貓流涎、口腔黏膜紅腫潰爛、口臭、進(jìn)食困難,進(jìn)而厭食消瘦,極大地影響了家養(yǎng)寵物貓及流浪貓的生活質(zhì)量。針對FCV 的檢測,由于FCV RNA 依賴的RNA 多聚酶缺少校正功能及低保真性,使得病毒的基因組有很高的重塑性極易發(fā)生抗原變異,這為臨床上檢測FCV 造成了極大困難[1-2]。目前除了常規(guī)的RT-PCR 檢測方法,尚無針對FCV 可用的血清學(xué)商品化快速檢測試劑盒或檢測卡。

FCV 衣殼蛋白VP1 分為NTA、S、P1、P2 等結(jié)構(gòu)域,其編碼基因具有高度保守性,其中病毒顆粒最外表面的P2 結(jié)構(gòu)域是大多數(shù)中和表位所在的區(qū)域,因此可作為疫苗及檢測試劑盒制備中的首選蛋白[8]。本試驗利用已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-FCVVP1,通過原核表達(dá)獲取FCV-VP1 重組蛋白,以該蛋白作為包被抗原建立了FCV 間接ELISA 抗體檢測方法,經(jīng)檢驗具有良好的特異性,操作簡便,可重復(fù)性高。

利用本試驗建立的ELISA 方法檢測臨床收集的96 份貓血清,結(jié)果表明,其中40 份呈陽性,貓口炎就診病例陽性率為96.3%(26/27),貓口炎無關(guān)病例陽性率20.3%(14/69),該結(jié)果與此前報道的貓杯狀病毒與貓口炎的高度關(guān)聯(lián)性相符合。

本試驗成功建立了以原核表達(dá)的FCV-VP1 蛋白為基礎(chǔ)的FCV 間接ELISA 抗體檢測方法,具有廣泛的應(yīng)用前景。