高通量測序技術研究不同喂養(yǎng)和分娩方式對不同月齡嬰幼兒腸道菌群的影響

楊 莉，葛武鵬,*，梁秀珍，張 靜，王西寧，張 雪，崔秀秀，龔 勝

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西飛天乳業(yè)有限公司，陜西 寶雞 721100；3.楊凌示范區(qū)醫(yī)院，陜西 楊凌 712100；4.西安百躍羊乳集團有限公司，陜西 西安 710000）

微生物與人體高度共生，在人體腸道中數(shù)量、種類多，甚至被看作一個人體“器官”，其構(gòu)成極為復雜多樣，已有大量研究表明腸道微生物與人體的諸多疾病，如炎癥、肥胖癥、糖尿病、腫瘤等顯著相關[1-2]。人生初期的1 000 d是腸道菌群定植關鍵期，遺傳、環(huán)境、月齡、分娩方式及喂養(yǎng)方式均影響腸道微生物的定植[3-4]。在諸多因素中，喂養(yǎng)方式、分娩方式及月齡對腸道菌群影響較為顯著。有研究表明，喂養(yǎng)方式對6 月齡的嬰幼兒腸道菌群構(gòu)建和生長發(fā)育影響顯著[5-8]。母乳作為嬰幼兒的首選食物，除了能提供嬰幼兒所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)之外，還含有豐富的微生物信息及免疫因子，可使微生物快速定植在嬰幼兒腸道中，這些腸道菌群的定植有助于嬰幼兒先天免疫系統(tǒng)的形成[9]。母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒患病率（如過敏性疾病、自身免疫性疾病和肥胖癥等）大幅降低[9-11]。由于受到社會因素、生理原因、個人健康等因素的影響，我國母乳喂養(yǎng)率偏低，所以選擇適宜的配方奶粉對嬰幼兒成長發(fā)育至關重要。近年來，人們對山羊乳的營養(yǎng)價值、生物利用率及功能等方面進行了大量系統(tǒng)性研究，取得較大進展，以山羊乳為基質(zhì)的嬰配奶粉也越來越受到青睞，特別是對過敏或患腸道疾病的嬰幼兒尤為有益[12-13]。但目前對于羊乳配方粉、牛乳配方粉及母乳喂養(yǎng)對嬰幼兒腸道菌群構(gòu)建的影響鮮見報道。

分娩方式亦是嬰幼兒腸道菌群構(gòu)建的關鍵因素之一，影響著早期嬰幼兒腸道微生態(tài)的形成[14-15]，新生兒腸道菌群的構(gòu)建及多樣性主要取決于母體和新生兒之間的菌群交換，剖宮產(chǎn)破壞了母嬰之間腸道菌群的交換方式，使新生兒突然從子宮環(huán)境來到外界環(huán)境，從而造成新生兒的腸道菌群傳遞鏈條缺失，增加了嬰幼兒患腹腔疾病及肥胖的風險[1,16-17]。而目前尚鮮有在相同月齡、相同喂養(yǎng)方式下研究分娩方式對嬰幼兒腸道菌群的影響，也鮮有在相同月齡、相同分娩方式下喂養(yǎng)母乳、牛乳、羊乳配方粉對嬰幼兒腸道菌群影響的差異分析，不同的分娩方式及喂養(yǎng)方式對嬰幼兒腸道菌群的構(gòu)建具有重要的影響。因此，本研究基于高通量測序（Illumina）技術探討不同喂養(yǎng)方式、不同分娩方式（順產(chǎn)、剖宮產(chǎn)）對不同月齡（I段：0～6 個月、II段：6～12 個月、III段：12～36 個月）嬰幼兒腸道菌群構(gòu)建的影響，重點分析了在其他兩種因素相同的情況下，喂養(yǎng)方式、分娩方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響，降低其他差異造成的影響，從而為嬰配食品開發(fā)及嬰幼兒科學喂養(yǎng)提供較為準確的技術支撐，為嬰幼兒的健康成長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；GeneJET膠回收試劑盒、Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒 美國Thermo Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人單面超凈臺 蘇州凈化設備有限公司；TDL-5-A型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；立式蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；T100型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Ion S5TMXL美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 嬰幼兒糞便樣本的采集

糞便樣本采集于陜西地區(qū)0～36 個月內(nèi)健康嬰幼兒，均為足月正常體質(zhì)量新生兒，一周內(nèi)無腹瀉、無胃腸道病史、未使用過任何抗生素類藥物。根據(jù)采樣原則及分組共采集嬰兒糞便樣本54 份，包括0～6 月（I段）順產(chǎn)母乳喂養(yǎng)（MV1）嬰幼兒6 名，0～6 月剖宮產(chǎn)母乳喂養(yǎng)（MF1）嬰幼兒6 名，0～6 月順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)（YV1）嬰幼兒6 名，6～12 月（II段）順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)（YV2）嬰幼兒6 名，12～36 月（III段）順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)（YV3）嬰幼兒6 名，6～12 月剖宮產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)（YF2）嬰幼兒6 名，12～36 月剖宮產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)（YF3）嬰幼兒6 名，6～12 月順產(chǎn)牛乳配方粉喂養(yǎng)（NV2）嬰幼兒6 名，12～36 月順產(chǎn)牛乳配方粉喂養(yǎng)（NV3）嬰幼兒6 名。采集糞便時，采取糞便內(nèi)部，避免混入尿液和其他雜質(zhì)，放于無菌采樣器中，并于2 h內(nèi)送入實驗室，凍存于－80 ℃冰箱。

1.3.2 DNA提取和測序

采用十六烷基三甲基溴化銨方法提取樣本的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和質(zhì)量濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板對16S rRNA基因V3～V4區(qū)對樣品進行PCR擴增。使用帶Barcode的特異引物（515F-806R）。根據(jù)PCR產(chǎn)物質(zhì)量濃度進行等體積混樣，充分混勻后使用1×TAE緩沖液配制的質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖膠電泳純化，剪切回收目標條帶。使用GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit法定量且文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

利用Uparse軟件[18]對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），對OTUs代表序列進行物種注釋，綜合運用Mothur方法、SILVA數(shù)據(jù)庫[19]和真核微生物的小亞基rRNA數(shù)據(jù)庫[20]對物種進行注釋分析，獲得分類學信息，并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件[21]進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的OTUs為標準進行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。Alpha多樣性分析反映樣品的菌群豐度和多樣性，其描述方法有Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)。Chao1、ACE指數(shù)越大，表明菌群豐度越高；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。Beta多樣性分析中的LefSe分析使用LefSe軟件，設置線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）得分的篩選值為4。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

菌群多樣性數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 20.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組嬰幼兒腸道菌群豐度及多樣性

圖1 各組嬰幼兒腸道菌群稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve of intestinal flora in infants from each group

由圖1可知，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，曲線趨于平緩，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。當測序數(shù)據(jù)量相同時，除III段嬰幼兒以外，順產(chǎn)嬰幼兒菌群多樣性高于剖宮產(chǎn)，這是因為剖宮產(chǎn)破壞了母嬰之間腸道菌群的交換，順產(chǎn)嬰幼兒菌群多樣性較高；羊乳配方粉喂養(yǎng)組菌群多樣性高于母乳喂養(yǎng)和牛乳配方粉喂養(yǎng)組，這為選擇合適的配方粉提供了參考依據(jù)。在順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)的嬰幼兒中，II段嬰幼兒菌群多樣性最高，III段次之，I段最低，推測與嬰幼兒的健康發(fā)育相關，II段作為嬰幼兒系統(tǒng)發(fā)育成熟的關鍵時期，生長所需營養(yǎng)及熱能量最多，故嬰幼兒腸道菌群最為豐富，多樣性最高。

2.2 分娩方式對相同喂養(yǎng)方式、相同月齡嬰幼兒腸道菌群的影響

表1 不同分娩方式各組嬰幼兒腸道菌群的OTU數(shù)量及Alpha多樣性Table 1 OTU number and alpha diversity of intestinal flora in infants born by different delivery modes

表1結(jié)果表明，在所有樣品中，I段母乳喂養(yǎng)組和II段羊乳配方粉喂養(yǎng)組不同分娩方式下微生物豐度差異不顯著，在III段羊乳配方粉喂養(yǎng)組中，分娩方式不同，微生物豐度差異顯著，這是由于III段嬰幼兒輔食種類多，從而導致微生物豐度差異較大[22-23]。同時，Alpha多樣性分析也表明，在I段、II段喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)和剖宮產(chǎn)組各指標差異不顯著，但在I段喂養(yǎng)組中Chao1指數(shù)差異顯著。在III段喂養(yǎng)組中，兩種分娩方式下嬰幼兒糞便腸道菌群的多樣性構(gòu)成存在明顯差異。

圖2 各組嬰幼兒腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of intestinal flora in infants from each group at the level of phylum

通過對所有樣品中微生物的16S rRNA基因V3～V4區(qū)序列進行測序，由圖2可知，共檢測到10 個主要菌門，但是所有樣品中99.09%以上的序列主要由4 個菌門組成，分別是Actinobacteria（放線菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidets（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）。所有樣品均以Actinobacteria、Firmicutes為優(yōu)勢菌門。MV1組中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria的相對豐度分別是43.74%、25.48%、17.93%、9.71%；MF1組分別為40.83%、44.31%、3.81%、11.01%；YV2組分別為41.44%、43.84%、8.38%、6.27%；YF2組分別為60.76%、24.85%、8.66%、5.70%；YV3組分別為26.58%、47.73%、24.07%、1.58%；YF3組分別為34.77%、51.94%、11.10%、2.16%；YV1組分別是62.98%、15.23%、15.45%、1.51%；YV2組分別是41.44%、43.84%、8.38%、6.27%；NV2組分別是54.20%、35.71%、3.91%、6.11%；YV3組分別是26.58%、47.73%、24.07%、1.58%；NV3組分別是13.87%、63.53%、21.29%、1.29%。在0～6 月母乳喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)嬰幼兒和剖宮產(chǎn)嬰幼兒優(yōu)勢菌群組成相同，但順產(chǎn)嬰幼兒Actinobacteria豐度較高，剖宮產(chǎn)嬰幼兒Firmicutes豐度明顯高于順產(chǎn)嬰幼兒；在6～12 月羊乳配方粉喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)嬰幼兒Firmicutes豐度高于剖宮產(chǎn)嬰幼兒，但剖宮產(chǎn)嬰幼兒Actinobacteria豐度高于順產(chǎn)嬰幼兒；在12～36 月羊乳配方粉喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)嬰幼兒Actinobacteria、Firmicutes豐度均低于剖宮產(chǎn)嬰幼兒。在0～6 月母乳喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)組檢測到了Verrucomicrobia（疣微球菌門），而剖宮產(chǎn)組沒有檢測到。盡管統(tǒng)計學分析表明4 種菌門在相同月齡、相同喂養(yǎng)方式下差異不顯著（P＞0.05），但分娩方式不同，優(yōu)勢菌門構(gòu)成比例存在一定差異。在0～6 月母乳喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)組比剖宮產(chǎn)組Actinobacteria相對豐度更高，F(xiàn)irmicutes較少，可能與剖宮產(chǎn)影響了新生兒的腸道菌群相關，本研究結(jié)果也為進一步了解分娩方式與嬰幼兒健康發(fā)育之間的關聯(lián)提供依據(jù)。

由圖3可以看出，在科水平上，在0～6 月母乳喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)組以Staphylococcaceae（鏈球菌科）為優(yōu)勢菌，而剖宮產(chǎn)組以Clostridiaceae（梭菌科）為優(yōu)勢菌；在6～12 月羊乳配方粉喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)組中優(yōu)勢菌為Enterobacteriaceae（腸桿菌科），剖宮產(chǎn)組中優(yōu)勢菌為Prevotellaceae（普氏菌科）；在12～36 月羊乳配方粉喂養(yǎng)組中，順產(chǎn)組以Bacteroidaceae（擬桿菌科）和Ruminococcaceae（瘤胃菌科）為優(yōu)勢菌，剖宮產(chǎn)組以Alcaligenaceae(糞產(chǎn)堿菌)為優(yōu)勢菌。

綜上，在相同喂養(yǎng)方式、相同月齡嬰幼兒中，分娩方式對嬰幼兒腸道菌群構(gòu)建多樣性影響不顯著，但是顯著影響主要優(yōu)勢菌的豐度。

圖3 各組嬰幼兒腸道菌群豐度聚類圖Fig. 3 Species abundance of intestinal flora in infants from each group

2.3 喂養(yǎng)方式對相同月齡、相同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的影響

表2 不同喂養(yǎng)方式各組嬰幼兒腸道菌群的OTU數(shù)量及Alpha多樣性Table 2 OTU number and alpha diversity of intestinal flora in infants fed by different methods

由表2可知，在I段順產(chǎn)組，羊乳配方粉喂養(yǎng)組OTU數(shù)量高于母乳喂養(yǎng)組，表明羊乳配方粉喂養(yǎng)組腸道菌群豐度較高；其ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于母乳喂養(yǎng)組，也表明了羊乳配方粉喂養(yǎng)組腸道菌群豐度較高；而兩組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無顯著差異。在II段順產(chǎn)組中，羊乳配方粉喂養(yǎng)組腸道菌群豐度略高于牛乳配方粉喂養(yǎng)組，但差異不顯著。王逸斌等[12]的研究表明，喂養(yǎng)羊乳配方粉對嬰幼兒的生長發(fā)育有促進作用，而本研究從基因?qū)哟侮U明了羊乳配方粉對嬰幼兒健康成長有一定的促進作用。在III段順產(chǎn)組中，兩種喂養(yǎng)方式差異顯著，這是由于12～36 月齡的嬰幼兒加入大量輔食，配方粉添加量相對較少[23]。

圖4 各組嬰幼兒腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性分析Fig. 4 Analysis of difference in intestinal community structure between groups

圖4 A顯示I段順產(chǎn)嬰幼兒中母乳喂養(yǎng)組和羊乳配方粉喂養(yǎng)組間有差異（R＞0），但差異不顯著（P＞0.05）；圖4B表明II段順產(chǎn)嬰幼兒中羊乳配方粉喂養(yǎng)組和牛乳配方粉喂養(yǎng)組無差異（R＜0）；圖4C表明III段順產(chǎn)嬰幼兒中羊乳配方粉和牛乳配方粉喂養(yǎng)組間差異極顯著（P＜0.01），與表4得到的結(jié)論一致。

圖5顯示，在屬水平上，I段順產(chǎn)嬰幼兒中，母乳喂養(yǎng)和羊乳配方粉喂養(yǎng)主要由Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Clostridium_sensu_stricto_1（梭菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）組成，羊乳配方粉喂養(yǎng)嬰幼兒的Bifidobacterium豐度大于母乳喂養(yǎng)，而母乳喂養(yǎng)嬰幼兒的Clostridium_sensu_stricto_1、Bacteroides豐度略大于羊乳喂養(yǎng)；II段順產(chǎn)嬰幼兒中，牛乳配方粉和羊乳配方粉喂養(yǎng)嬰幼兒在屬水平菌群組成無顯著差異，但羊乳配方粉喂養(yǎng)組Bacteroides、Enterococcus（腸球菌屬）豐度略大于牛乳配方粉喂養(yǎng)組，而Bifidobacterium、Streptococcus（鏈球菌屬）略小于牛乳配方粉喂養(yǎng)組；III段順產(chǎn)嬰幼兒中，兩組Bifidobacterium的豐度都明顯小于I、II段嬰幼兒，而羊乳配方粉喂養(yǎng)組Bifidobacterium、Bacteroides、Prevotella_9（普拉梭菌屬）的豐度都高于牛乳配方粉喂養(yǎng)組。這與之前的研究結(jié)果[7]有差異，可能的原因是本研究在相同的分娩方式、相同的月齡下進行，降低了其他差異造成的影響。因此，不同月齡下的嬰幼兒腸道菌群豐度有顯著差異，對于相同月齡、相同分娩方式的嬰幼兒，母乳、羊乳配方粉、牛乳配方粉喂養(yǎng)組腸道菌群組成無明顯差異，但豐度存在著一定的差異。

圖5 各組嬰幼兒腸道菌群在屬水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of intestinal flora in infants from each group at the level of genus

2.4 月齡對羊乳配方粉喂養(yǎng)順產(chǎn)嬰幼兒腸道菌群的影響

由圖2可以看出，在門水平上，0～6、6～12、12～36 月羊乳配方粉順產(chǎn)嬰幼兒中的優(yōu)勢菌組成無顯著差異，但其構(gòu)成豐度存在一定差異，4 種優(yōu)勢菌門分別占I、II、III段所有菌門的95.17%、99.94%、99.96%。Actinobacteria豐度在I段嬰幼兒中最高，II段次之，III段最低；Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria豐度在II段嬰幼兒中最高，I段次之，III段最低。說明隨著嬰幼兒的生長發(fā)育，腸道菌群有著明顯變化。因此，本實驗在相同的分娩方式和喂養(yǎng)方式下研究3 個月齡嬰幼兒腸道菌群的定植。

對3 個月齡階段順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)嬰幼兒進行LefSe分析，不同月齡嬰幼兒腸道菌群組成存在一定差異。如圖6A所示，6～12 月順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)組區(qū)別于其他兩組的微生物菌群分別是Enterococcaceae（腸球菌科）、Lactobacillales（乳桿菌目）、Bacilli（芽孢桿菌綱）、Clostridiaceae（梭菌科）、Veillonellaceae（韋榮氏球菌科）、Selenomonadales、Negativicutes、Enterobacteriaceae（腸桿菌科）、Enterobacteriales（腸桿菌目）；12～36 月順產(chǎn)羊乳配方粉喂養(yǎng)組中Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）是優(yōu)勢菌群。由圖6B可知，假鏈狀雙歧桿菌是0～6 月嬰幼兒中的優(yōu)勢菌種；Ruminococcaceae和青春雙歧桿菌是12～36 月嬰幼兒優(yōu)勢菌；Lactobacillales、Enterococcaceae、Clostridiaceae、Veillonellaceae是6～12 月嬰幼兒的優(yōu)勢菌。6～12 月嬰幼兒中腸道菌群最豐富。

圖6 不同月齡羊乳配方粉喂養(yǎng)順產(chǎn)嬰幼兒腸道菌群的差異Fig. 6 Difference in intestinal flora in infants of different ages

3 討 論

嬰幼兒腸道微生物的建立是一個復雜的過程，其定植的過程受多種因素的影響，其中喂養(yǎng)方式、月齡和分娩方式是嬰幼兒腸道菌群建立的主要因素。之前雖然有關于喂養(yǎng)方式和分娩方式對嬰幼兒腸道菌群影響的研究，但在相同月齡、相同喂養(yǎng)方式下分娩方式對嬰幼兒腸道菌群影響的研究甚少，而且鮮有研究在相同月齡、相同分娩方式下進行喂養(yǎng)母乳、牛乳、羊乳配方粉對嬰幼兒腸道菌群影響的差異分析。因此，本研究重點分析了在其他兩種因素相同的情況下，喂養(yǎng)方式、分娩方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響。

3.1 分娩方式對相同月齡、相同喂養(yǎng)方式嬰幼兒腸道菌群的影響

有研究表明，早期微生物在嬰幼兒腸道中的定植受分娩方式的影響，定植在順產(chǎn)和剖宮產(chǎn)嬰幼兒腸道中的微生物不同[22-24]。本研究通過高通量測序技術分析分娩方式對相同喂養(yǎng)方式、不同月齡下的嬰幼兒腸道菌群的影響，與文獻[22-24]的結(jié)果不同。結(jié)果表明，在I、II段喂養(yǎng)組中，分娩方式不同，嬰幼兒微生物豐度有差異但不顯著，而在III段喂養(yǎng)組中微生物豐度差異顯著，是由于III段喂養(yǎng)組輔食的添加占主導，嬰幼兒個體差異較大，最近也有研究表明分娩方式未對嬰幼兒生長發(fā)育產(chǎn)生影響[25]，也佐證了本研究結(jié)果。

3.2 喂養(yǎng)方式對相同月齡、相同分娩方式嬰幼兒腸道菌群的影響

一些研究報道，在新生兒期，母乳喂養(yǎng)和人工喂養(yǎng)嬰幼兒腸道菌群均以雙歧桿菌為優(yōu)勢菌，但在母乳喂養(yǎng)嬰幼兒腸道中雙歧桿菌豐度較高[26]；而人工喂養(yǎng)嬰幼兒糞便中擬桿菌、腸桿菌、梭菌、腸球菌、鏈球菌等的豐度要高于母乳喂養(yǎng)嬰幼兒[13]。另外一些研究認為，母乳喂養(yǎng)嬰幼兒與人工喂養(yǎng)嬰幼兒糞便中均含有大量的腸桿菌，而雙歧桿菌數(shù)量在兩組之間沒有太大區(qū)別[27]。早期對嬰幼兒腸道菌群的研究主要建立在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術上，研究結(jié)果存在較大爭議。近十幾年來，Haarman等采用熒光原位雜交及核酸探針技術對出生后20 d內(nèi)母乳喂養(yǎng)和人工喂養(yǎng)嬰幼兒腸道菌群進行了對比，發(fā)現(xiàn)所有母乳喂養(yǎng)嬰幼兒腸道均以雙歧桿菌為優(yōu)勢菌，其次是乳酸桿菌和鏈球菌；而人工喂養(yǎng)嬰幼兒腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量相似[28]。本實驗基于高通量測序技術，研究在月齡、分娩方式相同的情況下喂養(yǎng)方式對嬰幼兒腸道菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～6 月順產(chǎn)嬰幼兒中，Actinobacteria在羊乳配方粉喂養(yǎng)組占62.98%，遠高于母乳喂養(yǎng)組（43.74%）；羊乳配方粉喂養(yǎng)組雙歧桿菌豐度也高于母乳喂養(yǎng)組。這一結(jié)果作為喂養(yǎng)方式對嬰幼兒腸道菌群的新發(fā)現(xiàn)，對嬰幼兒配方粉的開發(fā)有一定價值。

雖然母乳喂養(yǎng)被認為是金標準，母乳是嬰幼兒生長發(fā)育最理想的營養(yǎng)物質(zhì)，但由于各種原因?qū)е挛覈溉槲桂B(yǎng)率偏低，而羊乳以其低致敏性和高營養(yǎng)價值的優(yōu)勢，更適合作為嬰幼兒配方奶粉的原料[13,25,29]。本研究采用高通量測序技術檢測，發(fā)現(xiàn)I段順產(chǎn)嬰幼兒中母乳喂養(yǎng)和羊乳配方粉喂養(yǎng)組間腸道菌群有差異但不顯著，母乳喂養(yǎng)和羊乳配方粉喂養(yǎng)主要由Bifidobacterium、Clostridium_sensu_stricto_1、Bacteroides組成，并且羊乳配方粉喂養(yǎng)的嬰幼兒Bifidobacterium豐度大于母乳喂養(yǎng)；II段順產(chǎn)嬰幼兒中羊乳配方粉喂養(yǎng)組和牛乳配方粉喂養(yǎng)組無顯著差異；III段順產(chǎn)嬰幼兒中羊乳配方粉和牛乳配方粉喂養(yǎng)組間差異明顯，兩組不同喂養(yǎng)方式Bifidobacterium的豐度都明顯小于I、II段嬰幼兒，而羊乳配方粉喂養(yǎng)組Bifidobacterium、Bacteroides、Prevotella_9的豐度都高于牛乳配方粉喂養(yǎng)組。

3.3 月齡對相同分娩方式、相同喂養(yǎng)方式嬰幼兒腸道菌群的影響

嬰幼兒腸道菌群的建立是一個動態(tài)演變的過程，而嬰幼兒期腸道微生物組成與機體病變有很大關系，因此研究嬰幼兒期腸道微生態(tài)以及合理建立尤為重要，但很少有對嬰幼兒0～36 個月整個階段腸道菌群變化的研究。本研究通過排除喂養(yǎng)方式和分娩方式的影響，選擇順產(chǎn)喂養(yǎng)羊乳配方粉的嬰幼兒，降低了其他因素的影響，利用高通量測序技術比較了嬰幼兒3 個階段腸道菌群的變化。發(fā)現(xiàn)3 個階段優(yōu)勢菌門都是由Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidets和Proteobacteria組成，但是豐度存在明顯差異，隨著月齡的增長，Actinobacteria和Bifidobacterium的豐度逐漸降低；6～12 月嬰幼兒Lactobacillales相對豐度較I、III段更高。本研究結(jié)果為配方粉的研發(fā)提供理論依據(jù)。

目前，關于分娩方式及月齡相同的條件下，羊乳配方粉對腸道菌群影響的研究甚少，故本實驗通過高通量測序技術研究了分娩方式、喂養(yǎng)方式、月齡對嬰幼兒腸道菌群的影響，表明相同喂養(yǎng)方式、相同月齡的嬰幼兒，分娩方式對其腸道菌群的影響有一定差異；相同分娩方式、相同月齡時，喂養(yǎng)羊乳配方粉的嬰幼兒腸道菌群豐度更高。本研究對相同分娩方式、相同喂養(yǎng)方式的嬰幼兒在生命初期（0～36 個月）腸道菌群組成、結(jié)構(gòu)進行分析，為嬰幼兒的健康、代謝及相關疾病的防御提供參考依據(jù)。