郁 杰，謝 晶,3,4,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷庫及制冷設備質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海 201306；4.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）是一種綠葉蔬菜，由中等大小的葉片組成，葉片厚實、顏色鮮綠，葉片和莖都可食用，低熱量且富含VA、VC以及鐵等微量元素，深受國內(nèi)外消費者青睞。鮮切蔬菜作為一種蔬菜商品化新形式逐漸進入人們視野，通常將蔬菜鮮切后置于4 ℃下待售[1]。但由于菠菜葉片面積較大、氣孔分布廣，極易受到腐敗菌侵染，一旦微生物進入氣孔內(nèi)部很難被清除[2]，且鮮切后的菠菜汁液流失、愈傷呼吸劇烈[3]，不耐貯藏；因此急需探尋適宜的保鮮方式延長鮮切菠菜的貨架期。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）結(jié)構(gòu)上由多個賴氨酸殘基聚合而成，是一種主要從鏈霉菌屬的代謝產(chǎn)物中分離提取得到的功能性多肽，屬于天然防腐劑，具有廣譜抑菌、熱穩(wěn)定性好等特點，被攝入后可降解成賴氨酸被人體吸收。ε-PL已于2003年10月被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準為安全食品保鮮劑[4]，我國GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[5]已規(guī)定可將ε-PL用于蔬果保鮮，且已有將其用于柑橘[6]、鮮切竹筍[7]等的保鮮研究。通常ε-PL可與有機酸等物質(zhì)聯(lián)合使用，具有明顯的協(xié)同增效作用，已有文獻證明：抗壞血酸鹽與ε-PL復合的保鮮劑處理鮮切蘋果[8]、鮮切甘薯[9]可有效防止褐變，具有優(yōu)異的護色性能，有利于維持品質(zhì)。但近年來，ε-PL應用于水果[10]、水產(chǎn)品[11]、肉制品[12]的保鮮研究較多，而對葉類蔬菜的保鮮研究較少；因此本實驗探究ε-PL和L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，AA）保鮮鮮切菠菜的可行性，以彌補該領(lǐng)域的不足。

本實驗通過抑菌圈實驗研究ε-PL和AA的抑菌效果，而后結(jié)合色澤、腐敗菌數(shù)量、水分變化、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力等指標，綜合探討ε-PL和AA保鮮鮮切菠菜的效果，為延長鮮切菠菜的貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜為大棚種植、有刺種，于10月份采摘，采摘時溫度約15 ℃，相對濕度約為80%，采摘后20 min內(nèi)由農(nóng)戶直接送至實驗室。所選菠菜大小均一、色澤鮮綠、清潔、無明顯缺陷、無病蟲毒害

AA 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（plate count agar，PCA）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基（pseudomonas cfc selective agar base，CFC）、腸桿菌科瓊脂培養(yǎng)基（violet red bile dextrose agar，VRBDA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（mannitol salt agar，MSA）島海博生物技術(shù)有限公司；ε-PL（相對分子質(zhì)量小于5 000）、草酸、氯化鈉、丙酮、碳酸鈣粉、2,6-二氯靛酚鹽、石英砂、2-硫代巴比妥酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；SOD試劑盒 南京建成生物科技有限公司；三氯乙酸（純度＞99%） 上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

H-2050R-1型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；HVE-50型高溫高壓滅菌鍋 日本Hirayama制造有限公司；WFZ UV-2100型紫外-可見分光光度計 上海龍尼柯儀器有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺 上?？蹈Ｌ丨h(huán)境科技有限公司；CR-400型色差計日本Konica Minolta公司；PQ 001型臺式脈沖核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；BCD-252MHV型冰箱 蘇州三星電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠菜的鮮切處理及分組

將樣品用自來水沖洗，除去表面泥污，晾干后用已滅菌的不銹鋼菜刀距菠菜葉片莖部約4 cm處進行鮮切。初篩時，將實驗分為對照組（去離子水）、單一處理組（0.005、0.05、0.5 g/Lε-PL溶液和1、10、100 g/L AA溶液，溶液均由去離子水配制，共6 組）和復合處理組（單一處理組的各質(zhì)量濃度混合液，共9 組），具體各組溶液配方見表1。將鮮切菠菜浸泡于上述保鮮液，30 s后取出瀝干，并通風晾干、分裝放入無菌托盤（70 g/盤），并用無菌聚乙烯保鮮膜包好，置于4 ℃下貯藏。

表1 單一及復合保鮮液實驗組Table 1 Single and combined preservative treatments

根據(jù)鮮切菠菜的貨架期結(jié)果初步篩選出各個處理組的最優(yōu)質(zhì)量濃度，進行下一步的指標測定。鮮切菠菜的水分遷移變化分別在第0、6、12天時測定，其余指標隔天測定一次。其中初篩時貨架期的確定以12 名普通消費對鮮切菠菜氣味、色澤、質(zhì)地、滋味進行評價，標準參照Paillart等[13]的方法。

1.3.2 保鮮劑抑菌性能評估

1.3.2.1 抑菌圈實驗

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、成團泛菌（Pantoea agglomerans）均從鮮切菠菜中提取并分離純化。以上菌種通過觀察細菌形態(tài)、菌落形狀、菌落顏色和進行H2O2酶實驗、氧化酶實驗、明膠水解、吲哚實驗、葡萄糖利用、V-P實驗、O-F實驗后，所得鏡檢和生理生化實驗結(jié)果與《伯杰細菌鑒定手冊》、鮮切菜品的鑒定圖譜[14]進行比對后驗證。參照石超等[15]的方法，采用牛津杯法測定金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、成團泛菌的抑菌圈直徑。

1.3.2.2 菌落總數(shù)及優(yōu)勢腐敗菌的計數(shù)

總菌及優(yōu)勢腐敗菌的培養(yǎng)見表2，并參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 菌落總數(shù)測定》[16]的方法計菌落總數(shù)。

表2 各種微生物的培養(yǎng)條件Table 2 Culture conditions for various microorganisms

1.3.3 感官評定

挑選12 名經(jīng)過培訓的評定人員進行感官評定，每實驗組隨機取樣評定3 次。標準參照Paillart等[13]的方法，對葉片的整體顏色及表觀、消費者的接受度、葉片萎焉程度（在白色背景下觀察）進行評價。分數(shù)越高代表品質(zhì)越好，隔天評定一次，每項評定滿分為10 分，各項總分之和取平均數(shù)，得到最終的總分。當總分低于5 分時，表明失去商品價值。

1.3.4 理化指標的測定

1.3.4.1 質(zhì)量損失率的測定

參照金文斌等[17]方法測定，根據(jù)式（1）計算質(zhì)量損失率。

式中：m0表示鮮切菠菜的初始質(zhì)量/g；mt表示貯藏時間t時鮮切菠菜的質(zhì)量/g。

1.3.4.2 色差的測定

色差參考Hasperué等[18]的方法并稍作修改。在隨機條件下，從不同處理組中取出菠菜樣品，在用白色校正板校準色差計后，測定各個葉片表面色度，記錄色差指標L*值（亮度）、a*值（紅綠程度）和b*值（黃藍程度）。當a*＞0、b*＞0時按式（2）計算色度角h/（°）；當a*＜0、b*＞0時按式（3）計算h。

1.3.4.3 葉綠素含量的測定

參照NY/T 3082—2017《水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定 分光光度法》[19]，使用分光光度法測定葉綠素含量，具體計算見式（4）。

式中：VT表示提取液的總體積/mL；n表示提取液的稀釋倍數(shù)；m表示鮮切菠菜質(zhì)量/g。

1.3.4.4 水分分布的測定

參照楊沖等[20]的實驗方法進行低場核磁共振（low field-NMR，LF-NMR）橫向弛豫時間T2譜圖的測定。各個樣品取樣要求位置一致，并剪成4.0 cm×3.0 cm尺寸的長方形。

1.3.4.5 丙二醛含量的測定

參照喬永祥等[21]的方法測定MDA含量。稱取1.0 g樣品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，研磨勻漿后，于4 ℃、10 000×g離心20 min，得上清液，取2.0 mL上清液加入2.0 mL、0.67 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液，混合后在沸水浴中煮沸20 min，取出流水冷卻后再在10 000×g條件下離心一次，分別取4 mL上清液在450、532、600 nm波長處測定吸光度，重復3 次。

1.3.4.6 SOD活力的測定

參照SOD測試盒中的羥胺法，上清液的制備：取1 g樣品葉片放入9 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，用勻漿機以15 000 r/min在冰浴條件下上下研磨制成勻漿液，在5 000×g的條件下離心10 min，取上清液。在測定管中分別加入75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）1 mL、待測樣品的上清液1 mL、0.1 mol/L鹽酸羥胺溶液0.1 mL、75 mmol/L黃嘌呤溶液0.1 mL和0.037 U/L黃嘌呤氧化酶0.1 mL，用漩渦混勻器充分混勻，對照管以1 mL蒸餾水代替上清液，37 ℃恒溫水浴30 min后取出，加入顯色劑2 mL混勻，室溫放置10 min，于550 nm波長處蒸餾水調(diào)零、比色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上指標每次測定設3 次平行，結(jié)果取平均值，并用Origin 8.5軟件繪圖，并使用SPSS Statistics 24軟件對組間數(shù)據(jù)進行Duncan’s新復極差法顯著性分析，P＜0.05代表存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 保鮮劑的初步選擇

圖1 單一、復合保鮮液處理后鮮切菠菜的貨架期Fig. 1 Shelf life of fresh-cut spinach treated with single and combined preservatives

如圖1所示，CK組的貨架期為8 d，對于ε-PL處理組，B組鮮切菠菜貨架期最長，為11 d；對于AA處理組，E組鮮切菠菜貨架期最長，為10 d；對于復合保鮮液處理組，K組鮮切菠菜貨架期最長，為12 d。故以CK組為對照，對B、E、K組進行詳細的理化指標分析。

2.2 保鮮劑對菠菜的抑菌效果

表3 牛津杯法測定不同保鮮液的抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of different treatments determined by Oxford cup assay

由表3及圖2可得，B、K組對菌落總數(shù)、假單胞菌（熒光假單胞菌）、腸桿菌（成團泛菌）、微球菌（金黃色葡萄球菌）均有不同程度的抑制，但E組無明顯抑菌作用。由圖2A可知，K組菌落總數(shù)在貯藏期間增長最緩慢，在貯藏末期（12 d）菌落總數(shù)為5.89（lg（CFU/g）），顯著低于CK、B、E組的6.32、6.23、6.42（lg（CFU/g））（P＜0.05）。由圖2B、C可知，B、K組在貯藏期前8 d對假單胞菌和腸桿菌具有明顯的抑制效果，且對假單胞菌的抑制效果差異不明顯，但從腸桿菌的抑制效果來看，K組顯著優(yōu)于B組。在10 d之后B、K組間對腸桿菌的抑制效果差異不顯著，但仍優(yōu)于E組，該結(jié)果同Papachristodoulou等[22]的研究結(jié)果一致。由圖2D可知，B組和K組僅在前4 d對微球菌具有抑制作用，且兩者抑制效果差異不明顯?？偟膩碚f，K組的抑菌性能優(yōu)于B組，E組無明顯抑菌性能。

圖2 鮮切菠菜貯藏過程中總菌及優(yōu)勢腐敗菌的變化Fig. 2 Changes in total bacteria and dominant spoilage bacteria in fresh-cut spinach during storage

2.3 不同保鮮劑處理對鮮切菠菜感官評分的影響

通過感官可以直觀地評價鮮切菠菜的品質(zhì)。由圖3可知，隨著貯藏時間延長，鮮切菠菜的感官得分呈下降趨勢，在貯藏前4 d各組樣品無顯著差異（P＞0.05），第8天時，CK組葉片出現(xiàn)大面積萎蔫、發(fā)黃和不同程度的軟腐，鮮切部位出現(xiàn)褐變，打開包裝可明顯感受到異味，且感官得分低于5 分，已失去商品價值。B、E、K組的鮮切菠菜在第8天僅出現(xiàn)小部分萎蔫，未見發(fā)黃、軟腐，打開包裝仍存在菠菜的固有氣味、無異味，這表明3 種保鮮液均可以延長鮮切菠菜的貨架期，減少軟腐，從而保持品質(zhì)。

圖3 不同處理方式對鮮切菠菜感官品質(zhì)的影響Fig. 3 Effects of different treatments on sensory quality of fresh-cut spinach

2.4 不同保鮮劑處理對鮮切菠菜色差的影響

隨著貯藏時間的延長，果蔬品質(zhì)會發(fā)生劣變，往往伴隨著色澤的變化，因此色差可以直觀地反映鮮切菠菜的品質(zhì)變化[23]，其中L*值代表明暗指數(shù)，色度角h值可以綜合反映葉片褪綠情況和黃化程度[18]。在貯藏前期，各樣品的L*值呈上升趨勢（圖4A），這是因為鮮切菠菜葉綠素分子被破壞導致亮度增加、黃化加速；在貯藏后期，各樣品的L*值呈下降趨勢，這是因為臨近貯藏終點時，一方面微生物大量繁殖；另一方面機體代謝紊亂同時又處于低溫環(huán)境易發(fā)生冷害，最終導致葉片軟腐、發(fā)黏，故顏色加深發(fā)黑，這也解釋了h值均呈下降趨勢的現(xiàn)象（圖4B）。從L*值來看，CK組在6 d后開始下降，B、E組樣品均在8 d后開始下降，而K組樣品則10 d后開始下降，這表明各實驗組均可有效延緩葉片發(fā)生冷害，從h值來看，K組樣品在整個貯藏期間變化幅度最小，其次是E組，最后為B組。綜上表明，K組鮮切菠菜色澤的變化是最緩慢的，冷害程度最小，最有利于維持鮮切菠菜的色澤品質(zhì)。

圖4 不同處理方式對鮮切菠菜L*（A）、h（B）的影響Fig. 4 Effects of different treatments on L* (A), h (B) of fresh-cut spinach

2.5 不同保鮮劑處理對鮮切菠菜葉綠素含量的影響

圖5 不同處理方式對鮮切菠菜葉綠素含量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on total chlorophyll content of fresh-cut spinach

采收后經(jīng)過鮮切處理的菠菜失去光合作用的能力，葉綠體自身不能更新且被分解，葉綠素分子遭到破壞，不僅含量降低還影響色澤[24]。由圖5可知，各處理組葉綠素含量均隨著時間的延長而降低，前4 d各組葉綠素含量差異不顯著，之后CK組葉綠素含量迅速下降，在第8天由初始值2.07 mg/g降至1.47 mg/g，而B、E、K組分別下降至1.61、1.59、1.70 mg/g；在貯藏后期（8 d后），各處理組葉綠素含量由高到低依次為：K組＞B組＞E組，這可能是因為8 d后鮮切菠菜表面細菌大量繁殖并產(chǎn)酸，改變了pH值，而葉綠素分子對pH值的變化極度敏感，加劇了脫鎂反應，導致葉綠素含量降低，而K組和B組具有良好的抑菌性能，極大地抑制了細菌產(chǎn)酸。

2.6 不同保鮮劑處理對鮮切菠菜質(zhì)量損失率的影響

圖6 不同處理方式對鮮切菠菜質(zhì)量損失率的影響Fig. 6 Effects of different treatments on water loss of fresh-cut spinach

質(zhì)量損失主要來自于水分蒸發(fā)和呼吸消耗兩個方面，其中水分蒸發(fā)引起的損耗是主要方面[25]。鮮切菠菜組織內(nèi)水分質(zhì)量分數(shù)約為92%，新鮮葉片挺直主要依靠體內(nèi)水分壓力，如果水分流失，細胞膨壓會降低，表觀上可以觀察到葉片萎蔫、皺縮，因此測定水分變化對評價鮮切菠菜樣品品質(zhì)十分重要。由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組質(zhì)量損失率逐漸增加，且CK組失水最快，在第8天質(zhì)量損失率超過5%，大部分葉片出現(xiàn)萎縮；復合處理組對控制鮮切菠菜的失水效果最好，兩個單一處理組的效果相近。

通過繪制并反演計算各個處理組在不同時期樣品T2弛豫時間，通過計算峰面積及峰比例可以反映樣品在貯藏前期（第0天）、貯藏中期（第6天）、貯藏末期（第12天）葉片中結(jié)合水（T21：0～2 ms）、不易流動水（T22：2～20 ms）、自由水（T23：20～1 000 ms）的遷移情況[26]。由表4可知，在0～6 d內(nèi)CK、E組中結(jié)合水相對含量分別下降6.0%、2.4%，B、K組結(jié)合水相對含量分別上升6.0%、1.2%。CK組和B組在0～6 d內(nèi)自由水相對含量分別下降8.9%、5.2%，高于6～12 d的下降幅度（3.7%、4.6%），這是因為經(jīng)過鮮切處理后的菠菜呼吸旺盛、代謝加快帶動機體更快地蒸騰失水[26]，故貯藏前期失水較快。到了貯藏末期，CK組結(jié)合水相對含量最低（0.69%），這表明細胞結(jié)構(gòu)已被破壞；B、E兩組自由水的相對含量仍為80%以上，這可能與ε-PL具有一定的成膜性相關(guān)，抑制了自由水相對含量的降低[7]。K組結(jié)合水相對含量增加，可能是因為復合處理增強了機體對不良環(huán)境的耐受，抗逆反應強烈主要通過減少自由水一方面使得機體新陳代謝速率下降；另一方面通過增加結(jié)合水含量增強抗逆能力[27]。

表4 不同處理方式對鮮切菠菜水分遷移的影響Table 4 Effects of different treatments on water mobility in fresh-cut spinach

2.7 不同保鮮劑處理對鮮切菠菜MDA含量、SOD活力的影響

圖7 不同處理方式對鮮切菠菜MDA含量的影響Fig. 7 Effects of different treatments on malondialdehyde content of fresh-cut spinach

鮮切菠菜在貯藏過程中，超氧陰離子自由基（O2－·）對細胞膜、線粒體內(nèi)膜中的不飽和脂肪酸進行攻擊，啟動并促進了膜脂過氧化進程[28]，該進程的主要產(chǎn)物是MDA，因此MDA含量是判斷膜脂過氧化程度的標志[29]。由圖7可知，各組樣品MDA含量隨著時間的延長而增加，但各個處理組的MDA含量整體上均低于對照組。在貯藏前6 d，E組MDA含量顯著低于B組，這表明AA能夠明顯抑制樣品細胞膜脂過氧化作用，與Liang Guobin等[30]的研究結(jié)果一致；但在第8天時，兩者MDA含量差異不顯著（P＞0.05）；K組在整個貯藏期間MDA含量均顯著低于其他處理組（P＜0.05）。

圖8 不同處理方式對鮮切菠菜SOD活力的影響Fig. 8 Effects of different treatments on SOD activity of fresh-cut spinach

SOD是植物氧化代謝中最重要的一種抗氧化酶，主要功能是與O2－·發(fā)生歧化反應，從而最大限度地清除O2－·[31]。由圖8可知，各組SOD活力均呈先上升后下降趨勢，這是因為SOD的活性隨植物體內(nèi)O2－·產(chǎn)生速率的升高而增加[32]，當O2－·生成量超過SOD的清除能力時，SOD活力就開始逐漸下降，表明機體內(nèi)O2－·的動態(tài)平衡被打破，機體將加速衰老。CK組和B組的樣品SOD活力在第4天達到最高，分別為230.15、227.21 U/g，E組和K組的鮮切菠菜分別在第6、8天達到最高值，分別為247.36、255.67 U/g。在第12天時，K組SOD活力最高（190.25 U/g），其次為E組，最后為B組。

綜合MDA含量和SOD活力的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復合保鮮液處理控制鮮切菠菜膜脂過氧化進程效果最好，MDA含量均顯著低于其他處理組（P＜0.05），同時SOD活力也保持最高，其次是AA單一處理，ε-PL單一處理效果不如其他兩種處理，但是在一定程度上仍優(yōu)于CK組。

3 結(jié) 論

在所有處理組中，K組處理（0.05 g/Lε-PL＋10 g/L AA）對鮮切菠菜的保鮮的效果最好，在貯藏期間可有效控制色澤發(fā)生劣變，抑制總菌、特定腐敗菌的增長，延緩膜脂過氧化進程，在貯藏末期，K組菌落總數(shù)最低，為5.89（lg（CFU/g）），SOD含量最高（190.25 U/g），貨架期最長（12 d）；0.05 g/L的ε-PL單一處理對鮮切菠菜具有良好的抑菌性能，但調(diào)控活性氧代謝能力一般，可使鮮切菠菜貨架期延長至11 d；10 g/L AA無明顯抑菌性能，主要是通過改善鮮切菠菜活性氧代謝維持品質(zhì)，貨架期可達10 d。