郭旭，陳乃東

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽六安237012；3.陸軍軍醫(yī)大學士官學校，河北石家莊050051）

商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）為商陸科植物商陸和垂序商陸的根，主產(chǎn)于河南、安徽、湖北等地。商陸味苦，性寒，有毒；歸肺、脾、腎、大腸經(jīng)，逐水消腫，通利二便，解毒散結，用于水腫脹滿，二便不通，治癰腫瘡毒[1]，為歷版中國藥典收載?，F(xiàn)代藥理研究表明，商陸富含多糖等化學成份[2-4]，具促進腹腔巨噬細胞吞噬功能，刺激小鼠脾淋巴細胞增殖及誘導脾細胞產(chǎn)生白介素-2、誘導小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生白介素-1、抗腫瘤等作用[5-11]。

響應面法（response surface methodology，RSM）是一種應用較廣的試驗優(yōu)化方法，由于采用了更為合理的試驗設計，能以最為經(jīng)濟的方式對試驗進行全面研究，可高效快速地確定多因子系統(tǒng)中最佳因子組合。本試驗利用響應面法從提取時間、提取溫度、液料比三方面對商陸總多糖提取工藝進行優(yōu)化，為商陸質量評價與資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料2016年11 月采自皖西學院藥用植物園，品種經(jīng)陳乃東教授鑒定為商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）。新鮮的商陸根，洗凈，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎，過40 目篩，備用。

蒽酮：上?？曝S實業(yè)有限公司；硫酸、三氯甲烷：西隴科學股份有限公司；D（+）-葡萄糖：廣州萬從化工有限公司；正丁醇：天津博迪化工股份有限公司；無水乙醇：上海振興化工一廠。以上均為國產(chǎn)分析純。

電子天平（FA-1004 型號）：上海精科天平廠；立式高速冷凍離心器（HR/T20MN）：湖南赫西儀器裝備有限公司；雙束紫外可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限責任公司；旋轉蒸發(fā)器（RE-2000）：上海洪旋實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 商陸多糖的提取

精確稱取商陸粉末約2 g，按設定液料比、提取溫度、提取時間提取后過濾獲總多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的測定

1.2.2.1 標準曲線及以葡萄糖計多糖含量測定

精確配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標準母液，精密量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 7 支帶塞刻度試管中，分別加雙蒸水至體積為1.0 mL，搖勻，于冰水浴中緩慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，冷卻后，100.0 ℃水浴中水浴10.0 min 后取出，冷卻至20 ℃，以雙蒸水為空白對照，于620 nm 下測吸光度值，得吸光度與濃度的回歸方程a=8.256 7x+0.026 2，R2=0.990 1，在0～0.1 mg，吸光度（a）與濃度（x）呈良好的線性關系。

精密量取1.2.1 制備的總多糖提取液1.0 mL，按測定標準曲線相同的方法測吸光度，代入回歸方程，計算出以葡萄糖計商陸多糖含量。

1.2.2.2 換算因子的測定及多糖含量的測定

將1.2.1 制備的總多糖提取液適當濃縮，經(jīng)醇沉、反復Sevage 法脫蛋白[12-15]至無明顯中層后，收集上部水層，-50 ℃冷凍干燥獲精制多糖。

精密稱取精制多糖10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取1.0 mL，按1.2.2.1 所述方法測定其吸光度，按下式計算換算因子（F）：

式中：W 為精制多糖質量，mg；C 為多糖液中葡萄糖折合濃度，mg/mL；D 為稀釋因素。

本試驗條件下測得F=1.762 8。

將1.2.2.1 測定的以葡萄糖計多糖含量乘以換算因子，獲商陸多糖含量。

1.2.3 單因素試驗

將不同提取條件下測得商陸多糖的含量作為商陸多糖提取率，分別考察提取溫度、液料比、提取時間對多糖提取率的影響。試驗方案如下：

保持液料比 50∶1（mL/g）、提取時間 3 h，研究提取溫度 40、55、70、85、100 ℃對多糖提取的影響。

保持溫度70 ℃、提取時間3 h，考察液料比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1（mL/g）對多糖提取的影響。

保持溫度 70 ℃、液料比 50∶1（mL/g），考察提取時間為 1、2、3、4、5 h 對多糖提取的影響。

1.2.4 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，基于Box-Behnken 設計思路，運用Design-Expert 8.05b 軟件，分別以A 液料比、B 提取溫度、C 提取時間 3 個因素，以-1、0、1 表示其 3個水平（表1），多糖提取率為響應值，開展響應面法優(yōu)化多糖提取工藝。

表1 響應面法試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以商陸多糖提取率為評價標準，采用Design-Expert 8.05b 軟件分析測得的數(shù)據(jù)，確定商陸多糖的最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果如圖1 所示。

由圖 1a 可見，當液料比為 10∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）時，隨著液料比增加，多糖的提取率迅速增加，當液料比超過70∶1（mL/g）時，多糖提取率增長緩慢?？紤]液料比增加，后處理越費時、費力，從簡化工業(yè)生產(chǎn)后處理角度出發(fā)，試驗選擇液料比 30∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）作為進一步響應面法優(yōu)化的液料比范圍。

圖1 液料比、提取溫度與提取時間對多糖提取的影響Fig.1 The effects of liquid material ratio，extracting temperatures and extracting time on the yield of polysaccharide

從圖1b 可見，提取溫度對商陸多糖提取有明顯影響，當溫度由 40 ℃升為 55 ℃、85 ℃升為 100 ℃，提取率增長緩慢；當溫度從55 ℃升至85 ℃，多糖的提取隨溫度的增高迅速上升，因此，試驗選擇提取溫度55 ℃～85 ℃作為進一步響應面法優(yōu)化的溫度范圍。

由圖1c 可見，當提取時間由1 h 延長為2 h 時，多糖的提取率13.5%增加到14.1%，當提取時間由2 h 增加到4 h 時，多糖提取率由14.1%迅速增加到20.1%，4 h 后，隨著時間延長，提取率增加緩慢，因此，試驗選擇提取時間2 h～4 h 作為進一步響應面法優(yōu)化的提取時間范圍。

2.2 Box-Behnken試驗結果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 Box-Behnken 試驗設計方案及結果

采取Box-Behnken 軟件對單因素試驗所得數(shù)據(jù)計量分析，最終得到最佳的試驗結論。表2 為通過軟件分析之后得到的對商陸多糖提取的三因素三水平試驗設計及各試驗條件下的商陸多糖提取率。

表2 響應面法優(yōu)化試驗設計及結果Table 2 Experimental design and result of response surface methodology

2.2.2 回歸方程方差分析

依據(jù)表2 的結果，利用Design-Expert 8.0.5b 進行回歸分析，得到商陸多糖提取率（Y）與料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）多元非線性回歸方程：

Y=-11.5+0.2A+0.2B+10.8C+0.002AB+0.05AC+0.03BC-0.004A2-0.003B2-2.4C2

對該模型進行顯著性檢驗、方差分析，結果如表3所示。

表3 回歸模型顯著性檢驗結果Table 3 Significant test for regression model

續(xù)表3 回歸模型顯著性檢驗結果Continue table 3 Significant test for regression model

由表3 可見，該模型極顯著（F 值=8.63，P＜0.01），且失擬項（P=0.024 3）不顯著，說明該回歸方程擬合度好，受其它因素影響較小，可以用來預測商陸多糖的最佳提取工藝。此外，液料比的一次項（A）與二次項（A2）、提取時間的二次項（C2）極顯著（P＜0.01），提取溫度的一次項（B）與二次項（B2）、提取時間的一次項（C）、液料比與提取溫度的二次交互項（AB）、提取溫度與提取時間的二次交互項（BC）均顯著（P＜0.05），且各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。由顯著性檢驗中的決定系數(shù)R2=0.957 3，校正系數(shù)R2Adj=0.911 5可知，該模型中的預測值與實際值的相關性較高，并且能較好地反映出各個因素對商陸多糖提取率的影響。通過對上表的數(shù)學方差的統(tǒng)計和定量的分析，可以看出，各單因素對于多糖提取率的影響程度從大到小依次為液料比、提取時間、提取溫度。

2.2.3 響應面圖分析

通過響應面優(yōu)化試驗分析得到相應的響應面圖，可以更加直觀地反映出各單因素對多糖提取的影響結果以及各單因素之間交互影響的強弱關系。液料比、提取時間、提取溫度這3 個因素兩兩交互作用的三維響應面與等高線圖見圖2。通過響應面圖可知，在所對應的范圍內存在極大值，即為各響應面的最高點，亦為等高線最內橢圓的中心點。

圖2 兩兩因素交互作用對多糖提取的影響Fig.2 Interactive effects of three factors on extracting polysaccharide

從圖2a 可知，液料比與提取時間對商陸多糖提取率的交互作用顯著，當液料比為 60∶1（mL/g）、提取時間為3.5 h 時，多糖提取率最高，從等高線圖亦可以看出，提取時間對響應值的影響更大。

從圖2b 可知，液料比與提取溫度對商陸多糖提取率的交互作用顯著，多糖提取率在液料比60∶1（mL/g）、提取溫度70 ℃時達到最高，等高線曲線斜率反映出提取溫度對多糖提取率影響更明顯。

從圖2c 可知，提取溫度與提取時間對商陸多糖提取率的交互作用顯著，提取溫度對多糖的影響占主導。在溫度70 ℃、提取時間3.5 h 時，多糖提取率較高。

綜合Design-expert 軟件分析結果可以得出，商陸多糖最佳提取工藝為：液料比 60∶1（mL/g）、溫度 70 ℃提取3.5 h 時，理論上此條件下多糖提取率為21.38%。

2.2.4 驗證試驗

為了對最優(yōu)提取工藝進行驗證，在液料比60∶1（mL/g）、提取溫度70 ℃、提取時間3.5 h 下進行3 組平行重復試驗，最終得到的商陸多糖的提取率為21.65%，與預測值的相差為1.26%，差異較小。故利用響應面優(yōu)化提商陸多糖得到的提取工藝真實可靠，明顯高于魯建江等采用微波提取測定的19.061%[16]，具有一定的實際應用價值。

3 結論

本研究通過響應面優(yōu)化法，對液料比、提取時間、提取溫度這3 個因素進行考察，并采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行分析，結果得出，液料比、提取時間與提取溫度對多糖提取率影響顯著，其影響順序為：液料比＞提取時間＞提取溫度。通過二次回歸方程，得到的最優(yōu)提取工藝為液料比 60∶1（mL/g）、提取時間 3.5 h、提取溫度70 ℃，商陸多糖的實際平均提取率為21.65%。