黃芪總苷通過介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞自噬和凋亡*

沈 瑩， 柳湘潔， 雷 超， 曾永孝， 艾 娟， 譚婉燕

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院1老年病科，2消化內(nèi)科， 湖北 武漢 430077)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的過程[1]。它既可以作為一種防御機(jī)制，清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損細(xì)胞，同時(shí)也可以作為一種細(xì)胞死亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡。自噬的調(diào)節(jié)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，許多信號(hào)通路包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/PI3K、beclin-1及Ca2+等都參與其中。mTOR是氨基酸和ATP的感受器，在自噬過程中發(fā)揮著門控作用，其活性是自噬體形成與成熟的關(guān)鍵[2]。

黃芪是一種傳統(tǒng)補(bǔ)中益氣藥，具有增強(qiáng)及調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌以及清除自由基等功能[3]。黃芪苷中的有效成分黃芪甲苷(astragalosides)具有抗應(yīng)激功效，可以在一定程度上減輕和消除應(yīng)激對(duì)機(jī)體生理機(jī)能的影響[4-6]。研究表明，黃芪甲苷能減少PC12細(xì)胞氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[5]。但是，黃芪總苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷引起的細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用尚未明確，所以本研究以此為切入點(diǎn)，觀察黃芪總苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的影響，為其合理應(yīng)用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

大鼠心肌H9c2細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，為H9c2(2-1)細(xì)胞株，這個(gè)細(xì)胞系具有許多骨骼肌的特性，成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)，如果培養(yǎng)液中的血清濃度下降到1%，融合發(fā)生得很快。流式細(xì)胞儀購自BECKMAN；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能公司。DMEM購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；吖啶橙熒光染色試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒以及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自Bioswamp。兔抗鼠mTOR、p-mTOR、P70S6K、LC3-I、LC3-II、caspase-3、GAPDH和羊抗兔IgG均購自Abcam；黃芪總苷4瓶，規(guī)格為20 mg，雷帕霉素4瓶，規(guī)格為20 mg，均購自湖北威德利化學(xué)科技有限公司。

2 主要方法

2.1體外培養(yǎng)大鼠心肌H9c2細(xì)胞 大鼠心肌H9c2細(xì)胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d進(jìn)行換液，吸去舊培養(yǎng)液，加入1 mL含0.25%胰酶消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞脫壁后立即加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入15 mL離心管內(nèi)，252×g離心3 min，速度離心后去除上清液，加入6 mL葡萄糖(濃度4.5 g/L)并添加含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，以每孔1×105的密度接種在6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2建立細(xì)胞模型及細(xì)胞分組[7]待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合50%～60%時(shí)，隨機(jī)分成4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)具體分組如下：(1)正常(normal)組：采用含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；(2)模型(model)組：在DMEM中加入200 μmol/L H2O2；(3)黃芪總苷組：在含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM中同時(shí)加入200 μmol/L的H2O2和20 mg/L的黃芪總苷[8]；(4)雷帕霉素(rapamycin)組：在含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM中同時(shí)加入200 μmol/L的H2O2和0.1 mg/L的雷帕霉素。各組均處理8 h。

2.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 H2O2誘導(dǎo)大鼠心肌H9c2細(xì)胞損傷結(jié)束后，消化離心制成單細(xì)胞懸液，4 ℃遇冷的70%乙醇固定，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)前去掉固定液，PBS清洗，加入DNA染料，碘化丙啶染色，室溫避光孵育20 min，采用Cell Quest軟件獲取細(xì)胞信號(hào)，并進(jìn)行細(xì)胞凋亡率分析。

2.4吖啶橙染色觀察細(xì)胞自噬程度 采用吖啶橙熒光染色試劑盒完成吖啶橙熒光染色。根據(jù)試劑盒說明書步驟操作如下：收集細(xì)胞，用吖啶橙染劑AO Stain Buffer(1×)清洗細(xì)胞1次，加入適量的1倍的吖啶橙染劑AO Stain Buffer(1×)重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×109/L。取適量的細(xì)胞懸液和吖啶橙染劑，按照細(xì)胞懸液和5 μL吖啶橙染劑為19∶1的比例混合，輕輕混勻。室溫避光染色15 min。滴加于載玻片上并加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡程度，并拍照。

2.5Western blot分析 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，每5 min振蕩1次，裂解20 min，4 ℃、13 700×g離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10% SDS-PAGE 2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育p-mTOR、mTOR、P70S6K、caspase-3和LC3 I抗過夜，TBST洗3次，每次10 min,室溫孵育II抗1 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用 BIO-RAD Image Lab 軟件進(jìn)行灰度值分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芪總苷抑制H9c2細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，模型組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞凋亡率為34.5%，顯著高于正常組的3.36%(P<0.05)；黃芪總苷組的細(xì)胞凋亡率為7.79%，顯著低于模型組和雷帕霉素組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The apoptotic rate of rat H9c2 cardiomyocytes in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05 vs model group.

圖1 大鼠心肌H9c2細(xì)胞凋亡率

2 黃芪總苷抑制H9c2細(xì)胞自噬

正常組和黃芪總苷組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核染色為綠色熒光，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞形狀規(guī)則；而模型組和雷帕霉素組細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則橘黃色自噬泡，染色質(zhì)凝聚、分塊，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞表現(xiàn)出自噬特征，見圖2。

3 p-mTOR/mTOR、P70S6K、自噬蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)

Western blot檢測(cè)顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌H9c2細(xì)胞的p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組和雷帕霉素組比較，黃芪總苷組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；各組大鼠心肌H9c2細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

與對(duì)照組比較，模型組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與模型組和雷帕霉素組比較，黃芪總苷組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.Autophagy of rat H9c2 cardiomyocytes in each group observed using acridine orange fluorescence method (×200).

圖2 吖啶橙染色法檢測(cè)各組大鼠心肌H9c2細(xì)胞自噬

討 論

LC3是自噬相關(guān)基因8(autophagy-related gene 8, Atg8)的同源物，是自噬體的標(biāo)志分子[9]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可以在一定程度上反映自噬體的數(shù)量和細(xì)胞自噬水平的高低[10-11]。caspase-3則是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，它的激活可以作為判斷細(xì)胞凋亡嚴(yán)重性的可靠指標(biāo)之一。若抑制caspase-3蛋白的激活表達(dá)，則可顯著減輕凋亡的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，與模型組和雷帕霉素組相比，黃芪總苷組大鼠心肌H9c2細(xì)胞的LC3-II/LC3-I和caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，心肌細(xì)胞的自噬是被抑制的，細(xì)胞凋亡程度較低，說明黃芪總苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能夠抑制細(xì)胞自噬，顯著提高心肌細(xì)胞存活率，降低心肌細(xì)胞凋亡程度。有研究表明，黃芪苷Ⅳ可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷[6]；黃芪總苷提取物能夠抑制心肌缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡[12]；黃芪多糖能通過提高心肌細(xì)胞存活率、改善抗氧化酶活性、抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用[13]。本研究得出的結(jié)論與上述已有研究結(jié)論一致。

Figure 3.Western blot was used to detect the protein expression in rat H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌H9c2細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)途徑，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等生理過程起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用[14-15]。P70S6K是mTOR下游信號(hào)之一，mTOR主要通過磷酸化其下游靶蛋白P70S6K來調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號(hào)通路[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組和雷帕霉素組比較，黃芪總苷組的大鼠心肌H9c2細(xì)胞p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表達(dá)顯著增加，提示黃芪總苷可增加p-mTOR和P70S6K的生成，從而抑制細(xì)胞自噬。這說明黃芪總苷可通過介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞自噬。

在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下，自噬的發(fā)生主要由mTOR通路調(diào)控。缺氧的信號(hào)使mTOR信號(hào)通路失活，從而激活自噬信號(hào)通路[2]。雷帕霉素是mTOR通路的抑制劑，可抑制mTOR磷酸化，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[17]。本研究中黃芪總苷促進(jìn)了H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞中mTOR的磷酸化，激活了mTOR信號(hào)通路，抑制細(xì)胞自噬，降低凋亡，起到了保護(hù)心肌細(xì)胞免于損傷的作用。這與誘導(dǎo)心肌細(xì)胞磷酸化其下游靶蛋白P70S6K，能夠顯著抵抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[18]的結(jié)論是一致的。

綜上所述，黃芪總苷可能通過mTOR信號(hào)通路抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞自噬，減少心肌細(xì)胞凋亡。