叢枝菌根真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花生理特征的影響

彭昌琴 徐玲玲 陳興銀

摘要：采用盆栽方法，用50、100、150、200、250、300 mg/kg這5種濃度的鎘液處理鳳仙花種子，研究叢枝菌根（AM）真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花生理特征的影響。結(jié)果表明，AM真菌能入侵鳳仙花的根部，且接種AM真菌的鳳仙花對(duì)不同濃度鎘脅迫的生理響應(yīng)程度不同，隨鎘脅迫濃度的增加，鳳仙花超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性均呈先升后降再升的趨勢(shì)，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性呈先降后升的趨勢(shì)，丙二醛（MDA）含量總體呈上升趨勢(shì);接種AM真菌時(shí)，鳳仙花SOD、POD、CAT活性均在鎘脅迫濃度為300 mg/kg時(shí)達(dá)到最大，分別為98.84、100.87、31.33 U/（g·min），MDA含量相對(duì)最高，為16.84 μmol/g;在200～300 mg/kg較高濃度鎘脅迫處理下，接種AM真菌處理的鳳仙花抗氧化酶活性高于無(wú)AM菌處理的，MDA含量低于無(wú)AM菌處理的。在鎘脅迫下，鳳仙花與AM真菌共同作用可提高其抗氧化酶活性、降低膜脂過(guò)氧化，促進(jìn)鳳仙花對(duì)重金屬鎘的吸收。

關(guān)鍵詞：鎘脅迫;叢枝菌根（AM）;鳳仙花;生理指標(biāo);抗氧化酶;MDA含量

中圖分類號(hào)： Q945.78;S681.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0186-03

近年來(lái)，我國(guó)由于工礦業(yè)與農(nóng)業(yè)等人為活動(dòng)而導(dǎo)致的土壤環(huán)境污染背景值增高，使得耕地土壤環(huán)境污染問(wèn)題突出[1]。近期頒布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)南方土壤污染較北方嚴(yán)重，且土壤重金屬污染中鎘（Cd）污染程度位居首位，其污染超標(biāo)率達(dá)7%[2]，重金屬鎘污染已嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)和人類健康[3-4]。土壤中的鎘元素具有極強(qiáng)的生物遷移性，易被植物吸收和積累，還可隨著生物鏈危及人類健康和生存，因此，有關(guān)土壤鎘污染的毒害效應(yīng)已經(jīng)越來(lái)越引起人們的關(guān)注[5]，對(duì)被重金屬鎘污染的土壤治理問(wèn)題急待解決。有研究表明，鎘對(duì)植物的毒害主要體現(xiàn)在抑制植株生長(zhǎng)、影響植物開(kāi)花、降低植株對(duì)逆境的抗性等[6-8]。鳳仙花（Impatiens balsamina L.）為鳳仙花科鳳仙花屬1年生草本花卉，生存力和適應(yīng)性很強(qiáng)。目前，鳳仙花在重金屬脅迫方面的研究多集中在Pb、Cd、Zn方面。有研究發(fā)現(xiàn)，鳳仙花在高濃度Pb、Zn脅迫下生長(zhǎng)受到一定影響，但能正常完成生活史，說(shuō)明鳳仙花對(duì)Pb、Zn具有較強(qiáng)的耐性[9]。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是一類可以和陸地上80%以上植物建立共生關(guān)系的微生物，可增強(qiáng)植物對(duì)土壤中養(yǎng)分尤其是難移動(dòng)養(yǎng)分的吸收[10-12]。Feng等研究表明，接種AM真菌可促進(jìn)玉米生長(zhǎng)，增加玉米植株對(duì)磷的吸收，使根可溶性糖含量提高[13];接種AM真菌的棉花其耐鹽能力得到一定程度增強(qiáng)[14]。目前，接種AM真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花生理抗性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以鳳仙花為材料，探究接種AM真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花生理指標(biāo)的影響，為重金屬污染的植物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鳳仙花種子，購(gòu)買(mǎi)于山東臨沂沃術(shù)花卉園;供試土壤，購(gòu)買(mǎi)于江蘇徐州江園園藝綠植之家;氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），分析純，購(gòu)買(mǎi)于貴陽(yáng)市賽蘭博生物試劑公司。AM菌種為摩西球囊霉，由貴州大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在貴州大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為3—6月，采用盆栽方法。挑選大小一致的鳳仙花種子，用0.5%高錳酸鉀消毒3～5 min，蒸餾水反復(fù)沖洗干凈;取口徑為21 cm的塑料盆，放置于托盤(pán)上以防止鎘溶液滲出，盆內(nèi)鋪上1層濾紙，向每個(gè)盆中放入500 g等量基質(zhì)，基質(zhì)由經(jīng)高溫滅菌、尼龍篩過(guò)篩的營(yíng)養(yǎng)土分別與滅菌（無(wú)AM真菌）、不滅菌的AM菌劑土按比例10 ∶ 1混勻制成;將等量、濃度分別為50、100、150、200、250、300 mg/kg的Cd2+溶液加入塑料盆中，以加入等量蒸餾水為空白對(duì)照;將鳳仙花種子播種在土壤里，每盆20粒，重復(fù)3次;用少許土掩蓋種子以促進(jìn)發(fā)芽，每隔1～2 d澆1次等量的蒸餾水。

1.3 AM侵染的檢測(cè)

鳳仙花培養(yǎng)3個(gè)月，用蒸餾水將鳳仙花根部清洗干凈，置于離心管中;向離心管中加入10% NaOH溶液，水浴鍋中 90 ℃ 水浴6～10 min;用蒸餾水清洗5～6次，再向離心管中加入30% H2O2溶液，水浴加熱直至根部完全漂白;蒸餾水沖洗干凈，用寶品紅染色5 min，再清洗干凈，并制成臨時(shí)玻片，在OLYPUS光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，考察菌根侵染情況。

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法測(cè)定[15-17];丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[15]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采樣Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用Adobe Photoshop軟件對(duì)圖片進(jìn)行裁剪。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌在鳳仙花根部的形態(tài)

AM真菌容易從比較幼嫩的根部侵入植物體內(nèi)，尤其是根冠及根尖分生區(qū)，也有從根毛區(qū)侵入的。由圖1可知，沒(méi)有接種AM真菌的鳳仙花根部細(xì)胞排列緊密，且細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有囊泡、叢枝結(jié)構(gòu)等存在（圖1-A）;接種AM真菌初期，AM真菌開(kāi)始萌發(fā)，在鳳仙花根部形成泡囊結(jié)構(gòu)（圖1-B），后繼續(xù)萌發(fā)成菌絲，形成叢枝結(jié)構(gòu)（圖1-C），這也說(shuō)明真菌已入侵到鳳仙花根部?jī)?nèi)。

2.2 AM真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性 SOD是生物體中清除氧自由基的重要酶之一，可保護(hù)生物膜、防止生物膜脂過(guò)氧化，其活性大小與逆境生長(zhǎng)下植物的抗逆性強(qiáng)弱密切相關(guān)[18]。由圖2可知，無(wú)AM真菌處理下，隨鎘溶液濃度的增加，鳳仙花SOD活性呈先降后升的趨勢(shì)，50 mg/kg鎘脅迫時(shí)鳳仙花的SOD活性相對(duì)最小，為30.22 U/（g·min），300 mg/kg鎘脅迫時(shí)達(dá)到最大，為98.84 U/（g·min）;接種AM真菌處理時(shí)，隨使用鎘濃度的增加，鳳仙花SOD活性呈先升后降再升的趨勢(shì)，鎘濃度為0 mg/kg （CK）處理時(shí)相對(duì)最小，為33.83 U/（g·min），300 mg/kg 鎘脅迫時(shí)達(dá)到最大，為113.50 U/（g·min）;接種AM真菌處理的鳳仙花SOD活性整體高于無(wú)菌處理的，說(shuō)明接種AM真菌可提高鳳仙花的SOD活性。

2.2.2 POD活性 POD的作用主要是將過(guò)氧化氫分解成H2O等物質(zhì)，以減輕過(guò)氧化氫對(duì)植物體的傷害，POD活性應(yīng)激性變化可反映逆境脅迫下植物受傷害的程度[19]。由圖3可知，無(wú)AM真菌處理下，0、50、100、150、200、250、300 mg/kg鎘脅迫處理的鳳仙花的POD活性分別為28.93、35.40、35.72、40.53、68.00、72.67、68.86 U/（g·min），呈先升后降的趨勢(shì)，經(jīng)鎘脅迫處理的鳳仙花的POD活性均高于對(duì)照;接種AM真菌處理時(shí)，隨使用鎘濃度的增加，鳳仙花POD活性呈先升后降再升的趨勢(shì)，除0、50 mg/kg鎘脅迫處理的鳳仙花POD活性低于無(wú)菌處理的外，其他濃度鎘脅迫處理的鳳仙花的POD活性均高于無(wú)菌處理，說(shuō)明接種AM真菌可提高鳳仙花對(duì)鎘的吸收;接種AM真菌處理下，鎘濃度為0 mg/kg時(shí)鳳仙花POD活性最小，為21.2 U/（g·min），300 mg/kg鎘脅迫時(shí)鳳仙花POD活性達(dá)到最大，為100.87 U/（g·min）。

2.2.3 CAT活性 CAT主要存在于過(guò)氧化物酶體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)等處，是植物細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的抗氧化酶，主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的過(guò)氧化氫，將其分解為H2O等物質(zhì)[18]。由圖4可知，無(wú)AM真菌處理下，隨使用鎘濃度的增加，鳳仙花CAT活性整體呈上升趨勢(shì)，50 mg/kg鎘脅迫時(shí)鳳仙花CAT活性相對(duì)最小，為10.97 U/（g·min），300 mg/kg鎘脅迫時(shí)達(dá)到最大，為22.72 U/（g·min）;接種AM真菌處理時(shí)，隨使用鎘濃度的增加，鳳仙花CAT活性呈先降后升趨勢(shì)，鎘濃度為0、50、150 mg/kg時(shí)鳳仙花CAT活性接低于無(wú)菌處理的，且相互間相差不大，說(shuō)明AM真菌在低濃度鎘脅迫時(shí)作用不明顯，而在鎘濃度為200、250、300 mg/kg時(shí)接菌處理的鳳仙花的CAT活性明顯高于無(wú)菌處理，說(shuō)明AM真菌在高濃度鎘脅迫作用下，可促進(jìn)鳳仙花對(duì)重金屬鎘的吸收。

2.3 AM真菌對(duì)鎘脅迫下鳳仙花MDA含量的影響

MDA是植物膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，是衡量細(xì)胞膜受損的重要指標(biāo)[20]。由圖5可知，無(wú)論接種AM真菌與否，隨使用鎘濃度的增加，鳳仙花MDA含量總體呈上升趨勢(shì)，且接種AM真菌處理的均低于無(wú)菌處理，說(shuō)明AM真菌在一定程度上可減輕鎘對(duì)鳳仙花的傷害;無(wú)菌處理下，鳳仙花MDA含量在0 mg/kg鎘脅迫時(shí)相對(duì)最小，為6.89 μmol/g，在鎘濃度為300 mg/kg時(shí)相對(duì)最大，為16.84 μmol/g;接菌處理時(shí)，0、50、100、150、200、250、300 mg/kg鎘脅迫處理的鳳仙花MDA含量分別為5.36、5.33、5.56、7.52、8.68、9.01、10.03 μmol/g，鎘濃度為0～100 mg/kg時(shí)鳳仙花MDA含量相差不大。

3 結(jié)論與討論

重金屬對(duì)植物來(lái)說(shuō)是一種逆境脅迫，在逆境中，植物會(huì)啟動(dòng)一系列防御機(jī)制來(lái)抵抗或者減輕逆境對(duì)自身的傷害。植物在良好的生長(zhǎng)環(huán)境中，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基含量很少，可通過(guò)植物自身的抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除以維持自由基的相對(duì)平衡[21];植物在惡劣的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，此時(shí)自身的保護(hù)系統(tǒng)無(wú)法及時(shí)清除，多余的活性氧自由基就會(huì)對(duì)植物造成毒害作用，阻礙植物生長(zhǎng)和代謝。研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根（AM）真菌通過(guò)提高宿主植物抗氧化酶活性來(lái)清除重金屬毒害產(chǎn)生的自由基，減少膜脂過(guò)氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常的滲透壓，進(jìn)而提高宿主植物的耐受性[22]。本研究中，接種AM真菌條件下，鳳仙花超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均隨使用鎘濃度的增加而多有明顯上升，抗氧化酶系統(tǒng)的活性相比無(wú)菌處理呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì)，鎘脅迫濃度為300 mg/kg時(shí)達(dá)到最大，分別為98.84、100.87、31.33 U/（g·min），說(shuō)明在重金屬脅迫下，AM真菌能提高抗氧化酶的活性以增強(qiáng)對(duì)活性氧的清除能力，從而達(dá)到減輕植物受傷害的目的[23];接種AM真菌的鳳仙花，其MDA含量隨使用鎘濃度的增加而增大，但與無(wú)菌處理相比，鳳仙花MDA含量明顯低于未接菌處理的，說(shuō)明AM真菌可降低膜脂過(guò)氧化作用，減少重金屬由根部向地上部的積累，也有可能AM真菌和重金屬形成絡(luò)合物，不利于重金屬穿過(guò)細(xì)胞膜，從而減輕了對(duì)細(xì)胞膜的傷害[24]。

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