生物結(jié)皮演替對(duì)高寒草原土壤微生物群落的影響

秦福雯， 康瀕月， 姜風(fēng)巖， 徐恒康， 周華坤， 位曉婷， 劉曉麗， 邵新慶*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 北京 100193； 2. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008)

生物土壤結(jié)皮(簡(jiǎn)稱生物結(jié)皮)是由生活在地表的特殊植物(藻類、地衣、苔蘚)和土壤微生物(細(xì)菌、真菌等)以及其他菌絲體、假根等與土壤顆粒物通過膠結(jié)作用形成的復(fù)合生命體[1-2]。生物結(jié)皮是干旱和半干旱地區(qū)典型的生命存在形式，在一些地區(qū)，生物結(jié)皮的覆蓋度甚至能達(dá)到70%以上[3-4]。它們對(duì)于干旱、半干旱區(qū)的土表穩(wěn)定、養(yǎng)分和水分循環(huán)具有十分重要的作用[1,5]。

生物結(jié)皮發(fā)育演替有特定的規(guī)律，一般根據(jù)生物結(jié)皮中的優(yōu)勢(shì)生物組分將生物結(jié)皮劃分為藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮、苔蘚結(jié)皮3種主要類型[6-7]。生物結(jié)皮的發(fā)育過程一般遵循“藻結(jié)皮-地衣結(jié)皮-苔蘚結(jié)皮”的演替規(guī)律，不同的生物類群會(huì)影響生物結(jié)皮的生態(tài)功能，有研究表明，不同發(fā)育階段的生物結(jié)皮在固氮、固碳效率[8]、抗壓強(qiáng)度[9]和土壤質(zhì)地[5]上具有顯著差異。另外，微生物是生物結(jié)皮形成的參與者，又受到生物結(jié)皮發(fā)育程度的影響[10]。有研究表明，生物結(jié)皮通過調(diào)節(jié)土壤溫度和濕度，能夠顯著影響土壤細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物的生物量和分布[11-12]，微生物的活性也隨著生物結(jié)皮的發(fā)育而持續(xù)增加[13]。根據(jù)吳麗等[14]在騰格里沙漠的研究，細(xì)菌、真菌和放線菌生物量隨著生物結(jié)皮的發(fā)育演替呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢(shì)，其生物量在不同演替階段中的關(guān)系為：蘚結(jié)皮>藻結(jié)皮>地衣結(jié)皮。根據(jù)李靖宇等[15]的研究，土壤表層在由流沙向藻結(jié)皮再向蘚結(jié)皮發(fā)育過程中，藍(lán)細(xì)菌和放線菌的生物量變化明顯，藍(lán)細(xì)菌的豐度先增高后減小，這也說明這兩類微生物在生物結(jié)皮演替過程中具有重要作用。

目前關(guān)于生物結(jié)皮演替與土壤微生物群落關(guān)系的研究多集中在荒漠地區(qū)，在草原生態(tài)系統(tǒng)，特別是在青藏高原高寒草原生態(tài)系統(tǒng)中關(guān)于生物結(jié)皮演替與土壤微生物群落的研究還相對(duì)較少。本研究以青藏高原地區(qū)高寒草原為研究區(qū)域，通過對(duì)土壤磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的分析，以期明確在高寒草原地區(qū)生物結(jié)皮的發(fā)育演替對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于青海省海南藏族自治州貴南縣森多鎮(zhèn)扎什給村天然草原(100°13′～101°33′ E，35°09′～36°08′ N)，高原大陸性氣候，年平均氣溫為2.3℃，年降水量為403.8 mm，年平均蒸發(fā)量為1 378.5 mm。植被類型為針茅化高寒草原，主要優(yōu)勢(shì)種有溚草(Koeleriacristata)、異針茅(StipaalienaKeng)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮嵩草(Kobresiahumilis)和矮火絨(Leontopodiumnanum)等。土壤類型以高山草甸土為主，在草地中鑲嵌著不同類型的生物結(jié)皮，根據(jù)其主要優(yōu)勢(shì)組分的不同，可將其分為藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮和苔蘚結(jié)皮。

1.2 調(diào)查與取樣

2018年8月7—10日期間在試驗(yàn)地開展調(diào)查和取樣。試驗(yàn)地圍欄為100 m×140 m，在圍欄樣地中設(shè)置3個(gè)20 m×100 m的樣帶，每個(gè)樣帶間隔20 m。在每個(gè)樣帶內(nèi)按之字形隨機(jī)設(shè)置12個(gè)25 cm×25 cm的小樣方。對(duì)樣方內(nèi)的生物結(jié)皮的蓋度、發(fā)育程度進(jìn)行記錄，將所有樣方分為4種類型，分別為Ⅰ類型(無生物結(jié)皮覆蓋)，Ⅱ類型(藻結(jié)皮覆蓋)，Ⅲ類型(地衣結(jié)皮覆蓋)，Ⅳ類型(苔蘚結(jié)皮覆蓋)，每個(gè)類型3個(gè)重復(fù)。使用取土器采集結(jié)皮覆蓋下的0～10 cm土壤，每個(gè)樣帶取12個(gè)土樣，分別進(jìn)行編號(hào)，最后將從3個(gè)樣帶中取得的相同編號(hào)的樣品混合成一個(gè)樣品，共得到12份樣品，土樣用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

表1 不同生物結(jié)皮覆蓋下土壤化學(xué)計(jì)量變化Table 1 Soil stoichiometric changes under different biological crusts

注：同列不同行小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)

Note:Different lowercases within column indicate significant difference at the 0.05 level

1.3 室內(nèi)分析

取部分鮮土，采用烘干法測(cè)定土壤含水量，另外的土樣分成兩份，一部分自然風(fēng)干后去除草根等雜物過篩(孔徑0.149 mm)，采用常規(guī)分析法測(cè)定土壤的化學(xué)成分，全氮用凱氏定氮法測(cè)定，全磷用高氯酸-硫酸消解鉬銻抗比色法測(cè)定，pH用Mettler Toledo酸度計(jì)測(cè)定，有機(jī)碳用Elementar快速碳硫分析儀測(cè)定[16];另一部分土壤暫放在—80℃冰箱中保存，并迅速用于土壤磷脂脂肪酸的測(cè)定。土壤磷脂脂肪酸的測(cè)定根據(jù)Bossio等[17]的方法測(cè)定，將土壤提取液(氯仿：甲醇：磷酸緩沖液=1∶2∶0.8)加入到土壤樣品中，利用硅膠柱(BE-Si，1gm/6mL)進(jìn)行分離純化，純化后的脂肪酸用KOH-甲醇溶液甲酯化，再加入十九烷酸甲酯(C19∶0)作為內(nèi)標(biāo)，用美國(guó)Agilent 689N型GC-MS分析結(jié)合Sherlock MIS 4.5系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System)完成檢測(cè)分析。特征脂肪酸的分類見表2。

圖1 不同生物結(jié)皮覆蓋下的地表(A為無結(jié)皮覆蓋，B為藻結(jié)皮覆蓋，C為地衣結(jié)皮覆蓋，D為苔蘚結(jié)皮覆蓋)Fig.1 The surface covered by different biocrusts (A is the non-crust cover,B is the algal crust cover,C is the lichen crust cover,and D is the moss crust cover)

表2 不同微生物種群磷脂脂肪酸微生物標(biāo)記Table 2 PLFA of different microbial communities

微生物Microorganism磷脂脂肪酸生物標(biāo)記PLFA Biomarker常見細(xì)菌Common bacteria14∶0,15∶0,16∶0,17∶0真菌 Fungus18∶1 ω9с,18∶2 ω6с放線菌 Actinomycetes16∶0 10-methyl,17∶0 10-methyl,18∶0 10-methyl厭氧菌Anaerobic bacteria18∶1 ω7с革蘭氏陽性菌G+Gram-positive bacteria13∶0 iso,15∶0 iso,15∶0 anteiso,16∶0 iso,17∶0 iso,17∶0 anteiso,18∶0 iso革蘭氏陰性菌G-Gram-negative bacteria16∶1 ω9с,16∶1 ω7с,18∶1 ω5с,19∶0 cyclo ω7сAM真菌Arbuscular mycorrhizal fungi16∶1 ω5с

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016和SigmaPlot 12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及圖表制作，采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法對(duì)不同類型土樣的微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用R 3.5.1 中的factoextra包對(duì)土壤磷脂脂肪酸進(jìn)行聚類分析(K-means)和利用vegan、ggplot 2包進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。所有數(shù)據(jù)結(jié)果使用算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物結(jié)皮覆蓋下土壤PLFA生物標(biāo)記數(shù)量和結(jié)構(gòu)的總體變化

2.1.1PLFA生物標(biāo)記種類數(shù)和標(biāo)記量的變化 在不同類型土樣中的PLFA種類和特征峰值如表3所示。在所有土樣中共出現(xiàn)了22種PLFA，在Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ類型中所有22種PLFA均有出現(xiàn)，在Ⅱ類型土壤中出現(xiàn)了21種PLFA，其中17:0 10-methyl沒有在Ⅱ類型土壤中出現(xiàn)。

各特征PLFA含量的大小，因生物結(jié)皮的覆蓋和類型有所不同(表3)，如屬于常見細(xì)菌的17∶0，其生物含量在Ⅳ階段達(dá)到最高，各類型含量的大小順序依次為：Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ；屬于真菌的18∶2ω6c，其生物量在Ⅰ類型土壤中達(dá)到最高值，各類型含量的大小順序依次為：Ⅰ>Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ；屬于放線菌的16∶0 10-methyl，其生物量在Ⅳ階段達(dá)到最高值，各類型含量的大小順序依次為Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。

2.1.2PLFA生物標(biāo)記分布結(jié)構(gòu)變化 在所有的22種磷脂脂肪酸中，表征常見細(xì)菌的16∶0比例最高，在磷脂脂肪酸總量中占比達(dá)到15%；表征真菌的18∶1ω9с在磷脂脂肪酸總量中占比為14%；表征厭氧菌的18∶1ω7с在磷脂脂肪酸總量中占比為10%；表征革蘭氏陰性菌的ω在磷脂脂肪酸總量中占比為8%。表征放線菌的16∶0 10-methyl在磷脂脂肪酸總量中占比為7%；表征革蘭氏陽性菌的15∶0 iso在磷脂脂肪酸總量中占比為5%；表征AM真菌的16∶1 ω5с在磷脂脂肪酸總量中占比為5%(圖2)。

在4種不同類型的土壤中，磷脂脂肪酸的種類和比例發(fā)生了變化(圖2)，在Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ類型中有22種PLFA出現(xiàn)，在Ⅱ類型土壤中只出現(xiàn)了21種PLFA。另外，在4種不同土壤中比重變化較大的有18∶2ω6c,17∶0 10-methyl,13∶0 iso和16∶0 iso。

表3 土壤微生物PLFA反應(yīng)值動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes of soil microbial PLFA reaction values

2.2 土壤微生物結(jié)構(gòu)分析

在對(duì)不同類型的土壤進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在不同土壤中微生物的組成和結(jié)構(gòu)都有一定的差異(圖3)。在Ⅰ類型土壤微生物中，革蘭氏陽性菌生物量最高，常見細(xì)菌、真菌和革蘭氏陽性菌(G+)生物量要顯著高于放線菌、厭氧菌和AM真菌；在Ⅱ類型土壤中，革蘭氏陽性菌(G+)生物量最高，常見細(xì)菌和革蘭氏陽性菌生物量顯著高于AM真菌；在Ⅲ類型中，革蘭氏陽性菌生物量最高，常見細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽性菌生物量顯著高于放線菌、厭氧菌和AM真菌；在Ⅳ類型土壤中，常見細(xì)菌生物量最高，常見細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽性菌生物量顯著高于放線菌、厭氧菌和AM真菌。在四種不同類型的土壤中，常見細(xì)菌的生物量變化為Ⅱ(77757)>Ⅰ(75062)>Ⅳ(66949)>Ⅲ(63220)。真菌的生物量變化為Ⅰ(68703)>Ⅱ(63802)>Ⅳ(62830)>Ⅲ(62346)。放線菌的生物量變化為Ⅳ(39258)>Ⅲ(36654)>Ⅱ(34020)>Ⅰ(29780)。厭氧菌的生物量變化為Ⅰ(39118)>Ⅱ(38107)>Ⅲ(32032)>Ⅳ(31490)。革蘭氏陽性菌(G+)的生物量變化為Ⅰ(84504)>Ⅱ(80415)>Ⅲ(67276)>Ⅳ(64809)。革蘭氏陰性菌的生物量變化為Ⅱ(56330)>Ⅰ(56086)>Ⅲ(52295)>Ⅳ(46418)。AM真菌的生物量變化為Ⅱ(20391)>Ⅰ(19440)>Ⅳ(19142)>Ⅲ(16873)。

圖2 土壤磷脂脂肪酸的結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Structure changes of soil phospholipid fatty acids

圖3 土壤微生物群落變化Fig.3 Changes of soil microbial community注：不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

2.3 土壤微生物PLFA生物標(biāo)記聚類分析

以表4中的PLFA的出現(xiàn)頻次、PLFA值總和、PLFA平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤作為指標(biāo)，以各PLFA為樣本，構(gòu)建分析矩陣，以歐氏距離為尺度，用K-means法進(jìn)行聚類分析，聚類的結(jié)果見圖4。根據(jù)聚類的結(jié)果，可以將所有PLFA分為三大類。

第一類(16∶0，18∶1 w9c，16∶0 10-methyl，18∶1 w7c，16∶1 w7c)特點(diǎn)為：出現(xiàn)頻次最高，PLFA值總和最高，PLFA的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤最高。

第二類(14∶0，15∶0，18∶2 w6c，18∶0 10-methyl，13∶0 iso，15∶0 iso，15∶0 anteiso，16∶0 iso，17∶0 iso，17∶0 anteiso，18∶0 iso，16∶1 w9c，18∶1 w5c，19∶0 cyclo w7c，16∶1 w5c)特點(diǎn)為：出現(xiàn)頻次較高，PLFA值總和較高，PLFA的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤較高。

第三類(17∶0，17∶0 10-methyl)特點(diǎn)為：出現(xiàn)頻次最低，PLFA值總和最低，PLFA的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤也是最低。

表4 土壤磷脂脂肪酸聚類分析指標(biāo)Table 4 Index of soil phospholipid fatty acid cluster analysis

圖4 土壤磷脂脂肪酸聚類分析Fig.4 Soil phospholipid fatty acid clustering analysis注：不同序號(hào)代表的磷脂脂肪酸種類見表4Note:The types of PLFA represent by different serial Numbers shown in table 4

2.4 土壤微生物和化學(xué)計(jì)量的相關(guān)性分析

將土壤因子和微生物生物量之間進(jìn)行冗余分析，結(jié)果顯示土壤因子與微生物生物量極顯著相關(guān)(P<0.01)。由圖5可見，土壤含水率、pH與土壤真菌、厭氧菌生物量呈顯著正相關(guān)，與常見細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、AM真菌生物量呈顯著負(fù)相關(guān)，與放線菌生物量無關(guān)。土壤全氮與厭氧菌、真菌生物量呈顯正相關(guān)，與放線菌、革蘭氏陽性菌生物量呈顯著負(fù)相關(guān)，與常見細(xì)菌、革蘭氏陰性菌、AM真菌無關(guān)。土壤全磷與放線菌、革蘭氏陽性菌呈顯著正相關(guān)，與常見細(xì)菌、真菌、革蘭氏陰性菌、AM真菌生物量呈顯著負(fù)相關(guān)，與厭氧菌無關(guān)。土壤有機(jī)碳與厭氧菌、真菌、放線菌生物量呈顯著正相關(guān)，與常見細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、AM真菌生物量呈顯著負(fù)相關(guān)。整體上看，真菌、厭氧菌和放線菌與土壤化學(xué)計(jì)量呈正相關(guān)，常見細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、常見細(xì)菌、AM真菌與土壤化學(xué)計(jì)量呈負(fù)相關(guān)。放線菌較多分布在Ⅳ(苔蘚結(jié)皮覆蓋下土壤)類型土壤中，真菌主要分布在Ⅰ(無結(jié)皮覆蓋土壤)和Ⅲ(地衣結(jié)皮覆蓋土壤)中，常見細(xì)菌、革蘭氏陰性菌和AM真菌分布較為均勻，在Ⅱ(藻結(jié)皮覆蓋土壤)、Ⅲ(地衣結(jié)皮覆蓋土壤)、Ⅳ(苔蘚結(jié)皮覆蓋土壤)中都有分布。

圖5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤因子冗余分析Fig.5 Analysis of soil microbial community structure and soil factor redundancy

3 討論

3.1 生物結(jié)皮與土壤理化性質(zhì)

生物結(jié)皮中包含多種固氮菌和藍(lán)藻，能將大氣中的N2還原、固定為可被生物利用的銨態(tài)氮[18]。Elbert等[4]研究得出，全世界生物結(jié)皮的每年固氮量可達(dá)到4500萬噸，約占全球生物固氮總量的40%。同時(shí)，作為具有生命活性的有機(jī)復(fù)合層，生物結(jié)皮可以從多個(gè)方面改變土壤的理化性質(zhì)。張?jiān)鞯萚19]發(fā)現(xiàn)在古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮可顯著增加表層土壤的有機(jī)質(zhì)含量；趙允格等[20]發(fā)現(xiàn)在黃土丘陵區(qū)生物結(jié)皮的形成顯著增加了結(jié)皮層土壤有機(jī)質(zhì)和氮含量。王蕊等[21]的研究也表明隨著生物結(jié)皮的發(fā)育土壤有機(jī)質(zhì)和全磷含量會(huì)顯著提升。另外，張繼賢等[22]發(fā)現(xiàn)在荒漠沙丘固定和生物結(jié)皮形成過程中，土壤pH值呈升高趨勢(shì)。而崔燕等[23]的研究表明，在生物結(jié)皮的形成過程中，土壤pH是呈下降趨勢(shì)的。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著生物結(jié)皮的產(chǎn)生和發(fā)育，土壤pH、全磷和有機(jī)碳含量并沒有發(fā)生顯著變化，而全氮含量隨著生物結(jié)皮的產(chǎn)生和發(fā)育呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與其他學(xué)者在沙漠地區(qū)的研究結(jié)果存在差異，這些差異可能與研究區(qū)域環(huán)境有關(guān)，本研究區(qū)域所處草原地區(qū)相對(duì)于荒漠地區(qū)養(yǎng)分含量較高，生物結(jié)皮的養(yǎng)分富集作用可能并沒有產(chǎn)生明顯作用，也可能是由于生物結(jié)皮的養(yǎng)分積累過程十分復(fù)雜，與外界環(huán)境的反饋、結(jié)皮層中微生物的礦化、大氣降塵對(duì)土壤環(huán)境的養(yǎng)分輸入和地表的侵蝕、堆積等過程有關(guān)。

3.2 生物結(jié)皮與土壤微生物群落

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中比較敏感的指標(biāo)，對(duì)周圍環(huán)境的變化會(huì)有迅速的反應(yīng)[24]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到土地使用歷史、植被覆蓋類型和其他多種環(huán)境因素的影響[25-26]。在生物結(jié)皮的生長(zhǎng)過程中，其覆蓋下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)受到其周圍植被、土地利用方式以及氣候條件變化的影響[27]。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，在所有供測(cè)樣品中共發(fā)現(xiàn)22種磷脂脂肪酸，這些脂肪酸在不同類型結(jié)皮覆蓋下的土壤中的出現(xiàn)頻次、相對(duì)生物量和離散程度都存在著差異，這與張秋芳等[28]對(duì)于土壤PLFA測(cè)定結(jié)果的描述一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高寒草原地區(qū)生物結(jié)皮的發(fā)育與土壤微生物群落間無顯著的相關(guān)性，該結(jié)果與其他研究者在沙漠地區(qū)的研究結(jié)果存在一些差異。另外，根據(jù)RDA分析的結(jié)果，各土壤因子對(duì)微生物類群的影響不同，其中厭氧菌和真菌受土壤因子的影響較大，幾乎受到所有土壤因子的影響，這說明影響它們生物量的因素較復(fù)雜。真菌的生物量主要受全氮的影響，放線菌的生物量主要受全磷的影響，這與陳法霖等研究[29]的結(jié)果相同，也說明土壤微生物群落的變化是多個(gè)土壤因子共同作用的結(jié)果[30]。

4 結(jié)論

青藏高原地區(qū)典型高寒草原不同生物結(jié)皮覆蓋下的微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。在所有供試土壤中共發(fā)現(xiàn)22種PLFA，表征7種微生物類群，其中常見細(xì)菌和真菌是主導(dǎo)微生物。各類群微生物生物量與生物結(jié)皮的發(fā)育演替無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。土壤因子與微生物生物量極顯著相關(guān)(P<0.01)，土壤真菌生物量與全氮含量顯著正相關(guān)(P<0.05)，放線菌生物量與全磷含量顯著正相關(guān)(P<0.05)?？梢?，在高寒草原生態(tài)系統(tǒng)中，生物結(jié)皮、土壤養(yǎng)分和微生物群落之間存在著較為復(fù)雜的相關(guān)性，仍需要進(jìn)一步地探索。