盛鳳仙，李 萍

(上海新興醫(yī)藥股份有限公司,上海 200135)

目前，上海新興醫(yī)藥股份有限公司采用國(guó)際先進(jìn)的低溫乙醇?jí)簽V法(Cohn法)[1-2]制備人血白蛋白等血液制品,該工藝生產(chǎn)過(guò)程中要求嚴(yán)格控制五大關(guān)鍵參數(shù)，分別是溫度、pH、離子強(qiáng)度、蛋白濃度和乙醇濃度，對(duì)前4個(gè)參數(shù)都已建立了檢測(cè)方法，并且進(jìn)行了測(cè)定，而乙醇濃度采用稱重法計(jì)算而得,該法誤差相對(duì)較大，會(huì)影響到產(chǎn)品的純度和得率。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保生產(chǎn)出持續(xù)穩(wěn)定的符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和注冊(cè)要求的產(chǎn)品，配合工藝驗(yàn)證的需求，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-5]，利用氣相色譜法對(duì)血液制品生產(chǎn)過(guò)程中中間品乙醇的含量測(cè)定方法進(jìn)行了探討。

1 材料

1.1 儀器與試藥

安捷倫6890N氣相色譜儀；無(wú)水乙醇(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.7%)；正丙醇(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.0%)；鎢酸鈉(AR)；硫酸(AR)；10%鎢酸鈉溶液(取鎢酸鈉10 g，加注射用水定容至100 ml)；0.33 mol/L硫酸溶液(取硫酸1.86 ml 緩緩注入適量注射用水中，放冷，定容至100 ml)，樣品由研究部提供(8%乙醇蛋白溶液，批號(hào)：ALB 20170119；20%乙醇蛋白溶液，批號(hào)：ALB 20170119；40%乙醇蛋白溶液，批號(hào)：ALB 20170119)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密吸取平衡至室溫的1.0 ml樣品溶液置于10 ml容量瓶中，精密加入0.2 ml正丙醇內(nèi)標(biāo)溶液，再加入1 ml 10%鎢酸鈉溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度，混勻，靜置30 min后，用0.45 μm水溶性膜過(guò)濾，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm ×30 m,1.4 μm)；FID檢測(cè)器；氣化室溫度230℃；檢測(cè)器溫度280℃；柱溫：40℃保持5 min后，以10℃/min升溫至80℃，再以50℃/min升溫至230℃，保持3 min；柱流量：1 ml/min；空氣：400 ml/min；氫氣：40 ml/min；分流比100∶1；進(jìn)樣量0.5 μl。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取不含乙醇的含蛋白0.1%的空白溶液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，不加正丙醇內(nèi)標(biāo)，加入1 ml 10%鎢酸鈉溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度,混勻,靜置30 min后用0.45 μm水溶性膜過(guò)濾，取0.5 μl按 “2.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖(圖1)；另外，分別取按“2.5”項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液和按“2.1”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液0.5 μl，同樣按 “2.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖(圖2、圖3)。從圖1可見(jiàn)，沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明處方中其他成分對(duì)乙醇含量測(cè)定無(wú)干擾；從圖3可見(jiàn)，乙醇峰與正丙醇峰完全分離，分離度大于1.5，互不干擾，專屬性好。

圖1 空白溶液色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖1.乙醇；2.正丙醇內(nèi)標(biāo)

圖3 供試品溶液色譜圖1.乙醇；2.正丙醇內(nèi)標(biāo)

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

從圖2可知，乙醇峰與正丙醇內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間分別約為4.4 min和7.5 min；乙醇峰與正丙醇內(nèi)標(biāo)峰分離度為41.07，乙醇峰理論塔板數(shù)為54 888，均符合《中國(guó)藥典》要求。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取無(wú)水乙醇對(duì)照品0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml，分別置于已預(yù)先加入適量注射用水的10 ml容量瓶中，再向各對(duì)照品容量瓶中精密加入0.20 ml正丙醇內(nèi)標(biāo)溶液,用注射用水定容至刻度，混勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以各乙醇對(duì)照品峰面積與正丙醇峰面積之比(X)，對(duì)乙醇對(duì)照品溶液濃度(Y，%)繪制曲線，得線性回歸方程為Y=2.728 5×10-3X+ 2.569 8，r=1.000 0。結(jié)果表明，乙醇對(duì)照品濃度在0.5%～5%范圍內(nèi)，乙醇對(duì)照品峰面積與正丙醇峰面積之比呈良好的線性關(guān)系。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密量取3.20、4.00、4.80 ml無(wú)水乙醇對(duì)照品，分別置于已預(yù)先加入適量不含乙醇0.1%蛋白溶液的10 ml量瓶中，用不含乙醇0.1%蛋白溶液定容至刻度，混勻后即得32.0%乙醇蛋白溶液、40.0%乙醇蛋白溶液、48.0%乙醇蛋白溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按 “2.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 乙醇回收率試驗(yàn)結(jié)果(%，n=9)

2.7 精密度試驗(yàn)

取按“2.5”項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液，并按 “2.2” 項(xiàng)下色譜條件操作，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積，結(jié)果乙醇對(duì)照品峰面積與正丙醇內(nèi)標(biāo)峰面積之比(X)的RSD為0.16 %，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取8%乙醇蛋白溶液(批號(hào)：ALB20170119)，按

“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8和12 h按 “2.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果表明乙醇對(duì)照品峰面積與正丙醇內(nèi)標(biāo)峰面積之比分別為0.317 1、0.317 3、0.317 6、0.317 3，RSD為0.06%，表明處理后樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批(批號(hào)：ALB20170206)40%乙醇蛋白溶液樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按 “2.2” 項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果樣品中乙醇含量分別為39.00%、39.31%、39.38%、39.43%、39.36%、39.46%，平均含量為39.32%，RSD為0.42%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取同一批樣品(批號(hào)：ALB20170119)而含不同濃度(8%、20%、40%)乙醇的蛋白溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按 “2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以線性回歸方程計(jì)算得到供試品中乙醇含量，結(jié)果均符合要求，詳見(jiàn)表2。

表2 樣品中乙醇含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)條件下，在空白溶液色譜圖中未見(jiàn)色譜峰出現(xiàn)，無(wú)其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，專屬性好；在本實(shí)驗(yàn)的典型圖譜中，乙醇與內(nèi)標(biāo)正丙醇相鄰兩峰完全分開，分離度大于2，乙醇峰理論塔板數(shù)大于10 000，符合藥典要求。

3.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：必須用校正過(guò)的移液器，以確保加入內(nèi)標(biāo)正丙醇的量準(zhǔn)確，混合必須充分均勻，沉淀蛋白必須完全，這樣才能確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 本法優(yōu)點(diǎn)

本法以正丙醇作為內(nèi)標(biāo)，與其他方法(如比色法)[6-8]相比，具有操作簡(jiǎn)單、方法靈敏、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于血液制品生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)中間品乙醇含量的測(cè)定。