長江刀鱭選育群體轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的分布特征分析*

于愛清 施永海 徐嘉波 陸根海 張海明 謝永德 劉永士

長江刀鱭選育群體轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的分布特征分析*

于愛清 施永海①徐嘉波 陸根海 張海明 謝永德 劉永士

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 上海 200433)

本研究利用MISA軟件挖掘長江刀鱭()肌肉和肝臟轉(zhuǎn)錄組中的微衛(wèi)星標(biāo)記，為刀鱭選育群體的種質(zhì)資源評(píng)估和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，從71869條Unigenes中共獲得33896條重復(fù)單元長度為1~6堿基的微衛(wèi)星序列；刀鱭轉(zhuǎn)錄組中不同類型微衛(wèi)星的重復(fù)基序具有不同的分布特征，其中，單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)為主要的微衛(wèi)星重復(fù)類型，分別占總微衛(wèi)星數(shù)目的34.94%、49.47%和13.34%；不同微衛(wèi)星重復(fù)類型的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序亦有所不同，其中，A/T為單核苷酸重復(fù)基序的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序占86.25%，AC/GT為二核苷酸重復(fù)基序的為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序占75.25%，AGG/CCT為三核苷酸重復(fù)基序的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序占28.57%；不同微衛(wèi)星重復(fù)基序核苷酸的數(shù)量和重復(fù)次數(shù)亦有所不同，重復(fù)次數(shù)伴隨著重復(fù)單元中核苷酸數(shù)量的增加而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；從100對(duì)四核苷酸重復(fù)的SSR引物中篩選獲得了16對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，并以此為基礎(chǔ)，對(duì)長江刀鱭選育群體(F3)的遺傳學(xué)特征進(jìn)行了初步評(píng)估，結(jié)果顯示，長江刀鱭選育群體F3的平均有效等位基因數(shù)(N)、平均觀測(cè)雜合度(H)、平均期望雜合度(H)和Shannon多樣性指數(shù)分別為1.7580、0.3414、0.3977和0.6278。以上結(jié)果表明，基于刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)批量開發(fā)微衛(wèi)星是切實(shí)可行的，所開發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記能夠應(yīng)用于長江刀鱭選育群體的遺傳背景評(píng)估和進(jìn)一步的遺傳育種研究。

刀鱭；轉(zhuǎn)錄組；微衛(wèi)星；分子標(biāo)記

刀鱭()隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬()，又名長頜鱭，俗稱刀魚、毛刀魚，主要分布于我國黃渤海、東海海域及通海的江河，其中，又以長江下游的產(chǎn)量最高，因其魚體豐腴肥滿、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美而享有“長江三鮮”之首的美譽(yù)(施永海等, 2014、2015; 鄧平平等, 2014)。歷史上，我國刀鱭的種質(zhì)資源極為豐富。然而，近年來，由于酷捕濫漁、水域環(huán)境污染、水文條件改變、生態(tài)環(huán)境惡化及海岸工程建設(shè)等諸多因素，長江刀鱭自然種質(zhì)資源急劇衰退，產(chǎn)量波動(dòng)很大，且呈現(xiàn)出逐年降低且個(gè)體日趨小型化的趨勢(shì)，甚至不能形成優(yōu)勢(shì)種群(施永海等, 2014、2015; 魏廣蓮等, 2013; 袁傳宓, 1988)，亟需對(duì)刀鱭的種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和恢復(fù)。而刀鱭基因組信息匱乏、遺傳背景不清晰、繁殖周期較長等問題亦在一定程度上制約了其種質(zhì)資源的開發(fā)和恢復(fù)。刀鱭種質(zhì)資源的有效保護(hù)和恢復(fù)，除了政府相關(guān)部門采取相關(guān)行政干預(yù)(建立禁漁期、加強(qiáng)捕撈監(jiān)管、適時(shí)增殖放流等)之外，還需相關(guān)部門適時(shí)地監(jiān)測(cè)洄游型刀鱭的遺傳多樣性，從整體上把握刀鱭野生群體的遺傳多樣性水平和遺傳背景，同時(shí)加快刀鱭良種的選育進(jìn)程，特別是分子標(biāo)記輔助良種選育的研究。

分子標(biāo)記由于能夠?qū)?dòng)物整個(gè)基因組的遺傳變異進(jìn)行探究，且相對(duì)穩(wěn)定，而被應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳育種研究，其中，微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite)的應(yīng)用最為廣泛。微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)，是指由1~6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列的重復(fù)單位和重復(fù)次數(shù)的差異使其具有高度變異性和多態(tài)性，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源評(píng)估和鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等方面(楊銘等, 2017; 管奧等, 2018; 白翠翠等, 2016)。近年來，學(xué)者利用線粒體基因D-loop(張燕萍等, 2017; Cheng, 2011)、線粒體Cytb (魏廣蓮等, 2012; Ma, 2010)、RAPD (馬春艷等, 2004)、AFLP(葛家春等, 2008)等方法研究了刀鱭不同群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳差異，而對(duì)刀鱭微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道相對(duì)較少。Rong等(2013)利用FIASO法構(gòu)建了微衛(wèi)星富集文庫方法，從89對(duì)刀鱭微衛(wèi)星引物中獲得了20對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。馬春燕等(2011)利用FIASO法構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫的方法，從70對(duì)刀鱭微衛(wèi)星引物中獲得了12對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。陳芳等(2012)利用磁珠富集法，從198對(duì)刀鱭微衛(wèi)星引物中獲得了34對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。鄧平平等(2014)利用磁珠富集法，從59對(duì)刀鱭微衛(wèi)星引物中獲得了9對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。利用磁珠富集法從水產(chǎn)動(dòng)物基因組中開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記，多態(tài)性相對(duì)較高，但相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率相對(duì)較低，且標(biāo)記大規(guī)模的開發(fā)成本相對(duì)較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足刀鱭高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助育種等對(duì)分子標(biāo)記需求量較大的研究，亟需大規(guī)模開發(fā)分子標(biāo)記。而高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)所開發(fā)的微衛(wèi)星，又被稱為表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)，其多態(tài)性雖然相對(duì)低于基因組所開發(fā)的微衛(wèi)星(G-SSR)，但由于數(shù)量多、通量大、周期短、成本低，且直接與某些功能基因相關(guān)聯(lián)(李東明等, 2017)，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物分子標(biāo)記大規(guī)模的開發(fā)研究。

本研究基于刀鱭肌肉和肝臟的高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)長江刀鱭轉(zhuǎn)錄組中的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選，分析刀鱭EST-SSR的序列特征、分布和組成等信息，并利用所篩選的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長江刀鱭選育群體(F3)的遺傳學(xué)特征進(jìn)行初步評(píng)估，以期能夠?yàn)榈恩q遺傳多樣性的分析、種質(zhì)資源的保護(hù)和利用、高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助良種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與數(shù)據(jù)來源

實(shí)驗(yàn)所用長江刀鱭來自于上海市水產(chǎn)研究所核心選育群體(F3)的2齡刀鱭，提取刀鱭肌肉和肝臟的RNA后，構(gòu)建高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫，利用Illumina HiSeq4000進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。刀鱭肌肉和肝臟的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總共獲得28.20 Gb的數(shù)據(jù)量，原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)Trinity軟件(http://trinityrnaseq.sourceforge. net/)組裝并去冗余后，獲得平均長度為932.49 bp的Unigenes 71869條，N50達(dá)到1364 bp，質(zhì)量不低于20的堿基比例(Q20)為97.31%，表明測(cè)序結(jié)果良好(未發(fā)表)。

1.2 EST-SSR的篩查

以刀鱭轉(zhuǎn)錄組中的Unigenes作為參考序列，利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)軟件(http: //pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)搜索刀鱭肝臟和肌肉轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)，其中，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別設(shè)置10、6、5、5、5和5。復(fù)合SSR兩個(gè)位點(diǎn)間最大間隔堿基數(shù)設(shè)置為100。

1.3 EST-SSR多態(tài)性引物的設(shè)計(jì)、篩選和初步驗(yàn)證

利用Primer Premier 3.0軟件對(duì)篩選出的微衛(wèi)星序列批量設(shè)計(jì)引物，主要設(shè)置參數(shù)為：引物長度和PCR產(chǎn)物分別為18~25 bp和100~500 bp，55℃≤退火溫度(T)≤65℃，40%≤GC含量≤60%，上下游引物的T≤2℃?？紤]到四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記相對(duì)二堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)具有較長的演化歷史和更加穩(wěn)定的突變積累，本研究隨機(jī)選取100對(duì)基于四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并以刀鱭核心選育群體(F3)為實(shí)驗(yàn)材料篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)后，利用銀染法顯色定影，條帶顯色清晰后用數(shù)碼相機(jī)拍照保存，進(jìn)行微衛(wèi)星引物后續(xù)的多態(tài)性分析。利用GenAlEx 6.0軟件(Peakall, 2006)計(jì)算長江刀鱭選育群體的有效等位基因數(shù)(N)、觀測(cè)雜合度(H)、期望雜合度(H)、Shannon多樣性指數(shù)()等遺傳多樣性參數(shù)。參照Bostein等(1980)的計(jì)算公式計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)：

式中，P、P分別為群體中第、個(gè)等位基因頻率，為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 刀鱭轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

利用MISA軟件挖掘刀鱭轉(zhuǎn)錄組中的EST-SSR標(biāo)記(搜索結(jié)果見表1)。從刀鱭71869條Unigenes中共獲得33896個(gè)SSR位點(diǎn)，占所評(píng)估序列總數(shù)目的47.16%；22463條Unigenes包含SSR位點(diǎn)，占總Unigenes的31.25%；含有1個(gè)以上的SSR位點(diǎn)的Unigenes有7701個(gè)，約占總Unigenes的10.71%；具有復(fù)合型SSR位點(diǎn)的Unigenes有2989個(gè)，約占總Unigenes的4.16%(表1)。

2.2 刀鱭EST-SSR的基序類型和頻率特征

基于微衛(wèi)星重復(fù)單元的類型和重復(fù)次數(shù)，將不同的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分類(表2)。結(jié)果顯示，從單核苷酸重復(fù)SSR到六核苷酸重復(fù)SSR在刀鱭轉(zhuǎn)錄組中均有分布，但數(shù)量分布上具有不同程度的差異。其中，二核苷酸重復(fù)SSR數(shù)量最多，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的49.47%；單核苷酸重復(fù)SSR數(shù)量次之，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的34.94%；三核苷酸重復(fù)SSR的數(shù)量亦較為豐富，占SSR總位點(diǎn)數(shù)的13.34%；四核苷酸重復(fù)SSR的數(shù)量相對(duì)較少，占SSR總位點(diǎn)數(shù)的2.11%；五核苷酸和六核苷酸重復(fù)SSR的數(shù)量最少，分別占SSR總位點(diǎn)數(shù)的0.09%和0.06%。

表1 刀鱭轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR位點(diǎn)的搜索結(jié)果

Tab.1 EST-SSR search results in the transcriptome of C. ectenes

此外，刀鱭轉(zhuǎn)錄組EST-SSR中共有94種核苷酸重復(fù)基序，主要核苷酸重復(fù)基序亦有不同類型的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序。其中，單核苷酸重復(fù)SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)锳/T，占86.25%，這可能與Poly A被納入計(jì)算結(jié)果有關(guān)；二核苷酸重復(fù)SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)锳C/GT，占75.25%；三核苷酸重復(fù)SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)锳GC/CTG和AGG/CCT，分別占27.16%和28.57%；四核苷酸重復(fù)SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)锳AAC/GTTT和ACAG/CTGT，分別占17.51%和16.81%。

2.3 刀鱭EST-SSR不同基序重復(fù)次數(shù)分布

刀鱭SSR主要重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)的分布情況見表3。刀鱭SSR基序的重復(fù)次數(shù)大部分為5~24次，其他重復(fù)次數(shù)相對(duì)較少，僅ATC/ATG出現(xiàn)了45次重復(fù)。低重復(fù)次數(shù)(5~9次重復(fù))的SSR位點(diǎn)最多，約占61.21%；中等重復(fù)次數(shù)(10~11次重復(fù))的SSR位點(diǎn)次之，約占22.84%；而>11次重復(fù)的SSR位點(diǎn)僅占15.95%。其中，單核苷酸基序重復(fù)次數(shù)均≥10，且重復(fù)11次以上的最多，占45.60%；二核苷酸基序以低重復(fù)次數(shù)為主，占92.26%，重復(fù)11次以上的較少，僅占0.02%；三核苷酸至六核苷酸基序均以重復(fù)次數(shù)為5的最多，其余重復(fù)次數(shù)的重復(fù)基序相對(duì)較少。

2.4 刀鱭EST-SSR多態(tài)性引物的初步篩選和分析

以本單位核心選育群體F3隨機(jī)選擇的30尾魚苗的基因組DNA為模板，針對(duì)100對(duì)四核苷酸重復(fù)SSR位點(diǎn)的引物進(jìn)行多態(tài)性檢驗(yàn)，最終篩選到16對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物(表4)。

基于16對(duì)經(jīng)篩選獲得的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)長江刀鱭核心選育群體(F3)進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估 (表5)。結(jié)果顯示，長江刀鱭核心選育群體(F3)的平均有效等位基因數(shù)(N)、平均觀測(cè)雜合度(H)、平均期望雜合度(H)和Shannon信息指數(shù)()分別為1.7580、0.3414、0.3977和0.6278?；诘任换蝾l率計(jì)算不同位點(diǎn)的多態(tài)信息含量，結(jié)果顯示，16對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記中，有2對(duì)屬于高度多態(tài)，10對(duì)屬于中度多態(tài)，4對(duì)屬于低度多態(tài)?？梢姡诘恩q轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的多態(tài)性EST-SSR能夠應(yīng)用于刀鱭選育群體的種質(zhì)資源評(píng)估，具有較高實(shí)用性。

表2 刀鱭轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR的主要重復(fù)基序的類型和數(shù)量

Tab.2 The type and number of main repeat motif of EST-SSR in the transcriptome of C. ectenes

表3 刀鱭轉(zhuǎn)錄組主要EST-SSR重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)

Tab.3 The repeat number of main repeat motif of EST-SSR in the transcriptome of C. ectenes

表4 刀鱭多態(tài)性微衛(wèi)星引物

Tab.4 Polymorphic SSR primers of C. ectenes

3 討論

微衛(wèi)星分子標(biāo)記在動(dòng)物進(jìn)化過程中，由于DNA分子的復(fù)制、缺失、滑移或錯(cuò)配及姐妹染色單體的不均交換等原因而具有高度變異性，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析(滕爽爽等, 2018)、親子鑒定(張丹等, 2018)、遺傳圖譜構(gòu)建(郭香等, 2013)、數(shù)量性狀定位(顧穎等, 2016)和分子標(biāo)記輔助育種(孫際佳等, 2017; 顧穎等, 2016)等方面的研究。對(duì)于具有基因組信息的物種而言，微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)相對(duì)方便；而對(duì)于目前還沒有基因組信息的物種，則可利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。刀鱭作為我國具有較高經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)和養(yǎng)殖價(jià)值的江海洄游性魚類，其基因組信息、轉(zhuǎn)錄組信息及可用分子標(biāo)記資源均極為匱乏，有鑒于全基因組測(cè)序的成本相對(duì)較高，因此，亟需開展刀鱭的轉(zhuǎn)錄學(xué)研究以獲得大量的可用分子標(biāo)記。此外，我國長江流域的刀鱭產(chǎn)量最為豐富，相應(yīng)的野生群體遺傳多樣性較高和資源分布較廣，是開展刀鱭遺傳育種研究的理想種質(zhì)資源庫。而本研究的刀鱭最初的繁育親本為長江流域的野生群體，歷經(jīng)3代高強(qiáng)度的人工選育，亟需適時(shí)地利用合適的分子標(biāo)記檢測(cè)其遺傳變異情況，以制定科學(xué)有效的育種策略。

表5 16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳參數(shù)

Tab.5 Genetic parameters at 16 microsatellite markers

本研究基于刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法挖掘刀鱭EST-SSR，獲得了33896條刀鱭EST-SSR，這些EST-SSR的種類較為豐富，且1~6核苷酸重復(fù)基序均有不同程度的分布。其中，以出現(xiàn)頻率為49.47%的二核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹?，其次是單核苷酸重?fù)基序(34.94%)，三核苷酸重復(fù)基序亦較為豐富，占13.34%，其他類型的核苷酸重復(fù)基序相對(duì)較少。蔡磊等(2015)研究表明，多數(shù)物種EST-SSR中的重復(fù)基序均以二核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹?，這與本研究結(jié)果一致；而其余類型的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序則有較大的差異，這可能與不同物種轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建的組織來源、不同物種的種間特異性、位點(diǎn)突變頻率及選擇性進(jìn)化機(jī)制有關(guān)。在刀鱭所有EST-SSR中，不同的核苷酸重復(fù)基序具有不同的重復(fù)次數(shù)，其中，單核苷酸重復(fù)基序大部分屬于中高等重復(fù)次數(shù)，其余類型重復(fù)基序的大部分重復(fù)次數(shù)在5~9之間，相對(duì)低于其他魚類基因組中的微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)，可能與編碼區(qū)和非編碼區(qū)所受到的選擇壓力差異有關(guān)。不同重復(fù)基序的堿基優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型表現(xiàn)出不同程度的偏倚性，單核苷酸重復(fù)基序以A/T類型為主，可能是由于富含A/T的微衛(wèi)星退火溫度相對(duì)較低，利于雙鏈DNA的解鏈，通過DNA復(fù)制的重組和滑動(dòng)機(jī)制而增加A/T重復(fù)基序的機(jī)率(倪守勝等, 2018)。而二核苷酸重復(fù)基序以AC/GT為主，這與魚類基因組微衛(wèi)星中以AC/GT重復(fù)為主相符；其余重復(fù)基序的優(yōu)勢(shì)重復(fù)堿基類型在不同物種間差異極大，可能與不同物種的種間差異性有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，刀鱭EST-SSR重復(fù)單元的拷貝次數(shù)隨著重復(fù)單元長度的增加而下降，微衛(wèi)星的數(shù)量亦呈現(xiàn)出逐步減少的趨勢(shì)。

近年來，相關(guān)學(xué)者在魚類中利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)陸續(xù)開發(fā)出了多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記。蔡磊等(2015)利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從諸氏鯔蝦虎魚()肝臟轉(zhuǎn)錄組中獲得6225個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并從76對(duì)引物中篩選獲得32對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。龔詩琦等(2016)利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從黃姑魚()轉(zhuǎn)錄組獲得12254個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，并從80對(duì)引物中篩選獲得18個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。岳華梅等(2016)利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從興國紅鯉()的垂體和性腺轉(zhuǎn)錄組中獲得13652個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，并從30對(duì)引物中篩選獲得了9個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究從100對(duì)四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星引物中篩選獲得了16對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，引物多態(tài)率相對(duì)低于其他魚類的研究結(jié)果。造成多態(tài)性較低的原因，一方面是由于本研究選取的四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星相對(duì)于二堿基和三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星比較保守，且變異率低；另一方面是由于基于轉(zhuǎn)錄所獲得的EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物可能跨越內(nèi)含子或者PCR引物位于內(nèi)含子和外顯子的結(jié)合處，而造成擴(kuò)增失敗導(dǎo)致多態(tài)率較低。此外，篩選多態(tài)性引物所用樣本的種類、數(shù)量、遺傳差異程度以及不同物種的DNA序列的保守性對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的篩選亦有不同程度的影響。

基于Botstein等(1980)對(duì)于多態(tài)信息含量(PIC)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)PIC>0.5、0.250.5、PIC<0.25時(shí)分別代表高度多態(tài)、中度多態(tài)和低度多態(tài)性。Rong等(2013)利用FIASCO法所開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記大部分為高度多態(tài)(70%)，中度多態(tài)占25%，而本研究所獲得的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記則大部分屬于中度多態(tài)(62.5%)，高度多態(tài)僅占12.5%，表明不同的微衛(wèi)星開發(fā)方法所獲得的位點(diǎn)多態(tài)性有所不同，而實(shí)驗(yàn)樣本的來源、數(shù)量和位點(diǎn)的核苷酸的重復(fù)基序、次數(shù)的不同位點(diǎn)多態(tài)性亦有不同程度的影響。雜合度作為度量群體遺傳變異的重要參考指標(biāo)，能夠有效反映出群體遺傳變異程度的高低。在本研究中，基于刀鱭多態(tài)性EST-SSR所獲得的刀鱭選育群體(F3)的平均觀測(cè)雜合度(H)和平均期望雜合度(H)分別為0.3414和0.3977，低于Rong等(2013)(H=0.49,H=0.68)、Ma等(2011)(H=0.675,H=0.650)、Chen等(2012)(H=0.53,H=0.77)利用磁珠富集法所獲的G-SSR的研究結(jié)果。究其原因，一方面是由于本研究選用的四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列在動(dòng)物進(jìn)化過程中相對(duì)保守，相對(duì)磁珠富集法所獲得的二核苷酸多態(tài)性和變異率較低，另一方面，本研究所選用的實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)過了3代高強(qiáng)度的人工選育，而其他研究樣本大部分為野生群體?？傮w而言，基于轉(zhuǎn)錄組所獲得的EST-SSR多態(tài)性雖然相對(duì)低于基于基因組所獲得的G-SSR，但仍然能夠有效區(qū)分個(gè)體或者群體的遺傳差異，加上所開發(fā)的微衛(wèi)星數(shù)量相對(duì)較多，具有相對(duì)較高的實(shí)用性。

本研究利用生物信息學(xué)方法篩選刀鱭高通量轉(zhuǎn)錄組Unigenes中的微衛(wèi)星標(biāo)記，分析刀鱭EST-SSR分布和組成特征，并利用所開發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記初步分析了刀鱭核心選育群體(F3)的遺傳特征。研究結(jié)果不僅豐富了刀鱭分子標(biāo)記的數(shù)量，而且對(duì)刀鱭后續(xù)選育群體的育種效果評(píng)估及分子標(biāo)記輔助育種實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

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Characteristic Analysis of Microsatellites in SelectedUsing a Transcriptome Dataset

YU Aiqing, SHI Yonghai①, XU Jiabo, LU Genhai, ZHANG Haiming, XIE Yongde, LIU Yongshi

(Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai Fisheries Technology Extension Station, Shanghai 200433)

The objective of this study was to identify microsatellites from the transcriptome sequences ofusing MISA software. These microsatellites could create very useful resources in the evaluation of germplasm resource and marker-assisted breeding of. The results showed that a total of 33,896 microsatellites were identified with repeating units, at lengths of 1~6 bases, from 71,869 unigenes. Different types of repeat SSRs had considerably different distribution characteristics. The majority of the microsatellite loci consisted of mono-, di-, and tri-nucleotide motifs (34.94%, 49.47%, and 13.34%, respectively). Dinucleotide microsatellite repeating units were the most abundant in thetranscriptome, and the AC/GT repeating units were the most ascendant repeating unit (75.25%). The dominant repeating units for the mononucleotide and trinucleotide motifs were A/T (86.25%) and AGG/CCT (28.57%), respectively. Different nucleotide repeat motifs had different repetitions that had a reducing trend, with the increase in the number of nucleotides in repeat motifs. Among the 100 designed primer pairs, 16 pairs proved to be polymorphic microsatellite markers. In the present study, 16 polymorphic microsatellite loci were characterized to evaluate the genetic diversity of the selected(F3). The results showed that the average number of effective alleles (N), the average observed heterozygosity (H), the average expected heterozygosity (H),and the average Shannon′s information index () of the selected(F3) were 1.7580, 0.3414, 0.3977, and 0.6278, respectively. These results indicate that it is feasible to develop microsatellite markers based on thetranscriptome and polymorphic microsatellite loci obtained in this study will facilitate further studies on the population genetic management and conservation of.

; Transcriptome; Microsatellites; Molecular markers

SHI Yonghai, E-mail: yonghais@163.com

* 上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2016)第6-2-2號(hào)]、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(17391900300)和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(11391901300)共同資助 [This work was supported by the Shanghai Key Scientific and Technological Project on Agriculture from Shanghai Municipal Agricultural Commission (2016-2-2), Shanghai Key Scientific Technological Project from Shanghai Science and Technology Commission (17391900300), and Shanghai Key Scientific Technological Project from Shanghai Science and Technology Commission (11391901300)]. 于愛清，E-mail: aiqingyu0125@163.com

施永海，教授級(jí)高級(jí)工程師，E-mail: yonghais@163.com

2018-08-02,

2018-08-29

S937.3

A

2095-9869(2019)05-0101-09

10.19663/j.issn2095-9869.20180802001

http://www.yykxjz.cn/

于愛清, 施永海, 徐嘉波, 陸根海, 張海明, 謝永德. 劉永士. 長江刀鱭選育群體轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的分布特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(5): 101–109

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(編輯 馮小花)