紫草素通過促進(jìn)硫氧還蛋白互作蛋白的表達(dá)抑制黑素瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取

封琳，左艷，曲璇，李軍

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽712046

惡性黑素瘤嚴(yán)重危害人類健康，其高侵襲和轉(zhuǎn)移特性是導(dǎo)致患者生存期短、死亡率高的主要原因[1]。近年來，惡性黑素瘤在我國的發(fā)病率逐年上升，在各類腫瘤增長速度中居首。因此，尋求有效的藥物，對(duì)黑素瘤的治療和預(yù)后評(píng)估均具有重要意義[2]。

紫草素來源于紫草，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑等功效[3]。近年來，紫草素在抗氧化、抗炎、抗血栓、增強(qiáng)免疫、抗增殖和促凋亡等多方面的功效也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，尤其是其抗腫瘤功效。研究顯示，紫草素及其衍生物抑制腫瘤增殖并誘導(dǎo)腫瘤凋亡和壞死的功能已在多種腫瘤中得到證實(shí)，如結(jié)腸癌[4]、白血病[5]和前列腺癌[6]等。在本研究中，我們探討了紫草素對(duì)黑素瘤細(xì)胞A375 和SK-MEL-28 生存的影響，并進(jìn)一步研究了其在調(diào)節(jié)腫瘤糖代謝中的作用，為深入理解紫草素抗腫瘤的功能打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

A375 細(xì) 胞、SK-MEL-28 細(xì)胞和NIH-3T3 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；紫草素購自上海田同生物技術(shù)有限公司；高糖DMEM 和無糖DMEM 購自HyClone 公 司；2-NBDG 購 自Thermo Fisher Scientific 公 司；real-time PCR試劑購自TaKaRa 公 司；小鼠抗人硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）單抗為Cell Signaling Technology 公司產(chǎn)品；小鼠抗人β-actin 單抗及Western印跡試劑盒為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將A375、SK-MEL-28 細(xì)胞或NIH-3T3 細(xì)胞以104/孔的密度接種至96 孔板，待細(xì)胞過夜貼壁后加入用DMEM 稀釋的濃度分別為0、1、5 μmol/L的紫草素，在處理后的0、1、2、3 d 時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每孔加入的MTT 溶液濃度為5 mg/mL，孵育4 h，吸棄上清液后，每孔加入100 μL DMSO 試劑溶解結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的D490nm值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 2-NBDG攝取實(shí)驗(yàn)

將A375 或SK-MEL-28 細(xì)胞以106/孔接種至6孔板，貼壁后分別用0、1、5 μmol/L 的紫草素處理細(xì)胞4 h，加入100 μmol/L 2-NBDG 試劑作用1 h，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.4 real-time PCR實(shí)驗(yàn)

將A375 或SK-MEL-28 細(xì)胞以106/孔接種至6孔板，貼壁后分別用0、0.5、1 μmol/L 的紫草素處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，用TRIzol 試劑提取mRNA，用TaKaRa公司的PrimeScript real-time PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR。TXNIP 上游引物為5'-ATATGGGTGTGTAGACTA CTGGG-3'，下游引物為5'-GACATCCACCAGATC CACTACT-3'；β-actin 上游引物為5'-CATGTACG TTGCTATCCAGGC-3'，下游引物為5'-CTCCTTAA TGTCACGCACGAT-3'。

1.5 Western印跡

用紫草素按上述方式處理A375 或SK-MEL-28 細(xì) 胞，24h后收集 細(xì) 胞，加入RIPA 蛋白 裂解液，超聲波裂解細(xì)胞，4℃離心取上清液，收集總蛋白。經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)（200 mA，2 h）至NC 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉NC 膜；2 h 后用1∶1000 稀釋的TXNIP 抗體于4℃孵育過夜，次日加入二抗孵育1 h，通過ECL 發(fā)光檢測劑顯示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖能力的影響

A375、SK-MEL-28 和NIH-3T3 細(xì)胞接種至96孔板，分別用不同濃度的紫草素處理細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。紫草素能夠以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式抑制A375 和SK-MEL-28 細(xì)胞的增殖能力，而對(duì)正常細(xì)胞NIH-3T3 則不具有顯著的抑制效果。

2.2 紫草素對(duì)黑素瘤細(xì)胞糖攝取能力的影響

為了進(jìn)一步明確紫草素是否對(duì)黑素瘤細(xì)胞糖代謝重編程的過程具有調(diào)控作用，在A375 和SK-MEL-28 細(xì)胞中檢測了不同濃度的紫草素對(duì)葡萄糖類似物2-NBDG 的攝取能力，結(jié)果見圖2。經(jīng)紫草素處理的A375 和SK-MEL-28 細(xì)胞對(duì)2-NBDG 的攝取能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），說明紫草素可能通過阻斷黑素瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的過程抑制細(xì)胞的增殖。

2.3 紫草素對(duì)TXNIP表達(dá)的影響

TXNIP 是抑制細(xì)胞攝取葡萄糖的關(guān)鍵基因，我們因此利用real-time PCR 和Western 印跡檢測了TXNIP 在紫草素處理過的A375 和SK-MEL-28細(xì)胞中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。為了避免高濃度紫草素對(duì)細(xì)胞活力的影響（如圖1，5 μmol/L 紫草素作用24 h 會(huì)顯著抑制細(xì)胞生存），選擇相對(duì)低濃度（0.5 和1 μmol/L）的紫草素。結(jié)果顯示，在紫草素處理后的黑素瘤細(xì)胞中，TXNIP 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著提高（P＜0.01）（圖3、4），提示紫草素可能通過促進(jìn)TXNIP 表達(dá)的方式抑制黑素瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力，并進(jìn)一步導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重編程。

圖1 紫草素抑制黑素瘤細(xì)胞A375 和SK-MEL-28 的增殖能力

圖2 紫草素抑制黑素瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力

圖3 紫草素誘導(dǎo)TXNIP mRNA 表達(dá)

圖4 紫草素誘導(dǎo)TXNIP 蛋白表達(dá)

3 討論

TXNIP 是α 抑制蛋 白 家族成員，受MondoA、mTORC1 等蛋白的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控。早期研究證明，TXNIP 可與硫氧還蛋白（Trx）結(jié)合形成二聚體，抑制Trx 的氧化還原特性，并進(jìn)一步影響Trx下游信號(hào)通路的活化和基因表達(dá)[7]。近年來，TXNIP 非Trx 依賴性結(jié)合途徑也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，通過調(diào)控能量代謝、炎癥反應(yīng)等過程，參與包括腫瘤在內(nèi)的諸多疾病的發(fā)生[8]。

TXNIP 與腫瘤代謝的相關(guān)性主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①TXNIP 是能量感受器，受葡萄糖、谷氨酰胺和AMPK 等重要代謝通路的調(diào)控。研究顯示，葡萄糖的代謝中間產(chǎn)物對(duì)TXNIP 具有轉(zhuǎn)錄激活作用[9]，而谷氨酰胺可通過影響MondoA 的轉(zhuǎn)錄活性抑制TXNIP 的表達(dá)[10]。AMPK 通路在ATP 比例下降時(shí)活化，可通過降解TXNIP 蛋白，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[9]。②TXNIP 通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1 的表達(dá)抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。TXNIP 對(duì)葡萄糖的攝取具有負(fù)調(diào)控作用，主要是通過負(fù)調(diào)控GLUT1 來實(shí)現(xiàn)的:一方面，TXNIP可促進(jìn)GLUT1 蛋白內(nèi)化，促進(jìn)其在胞內(nèi)降解；另一方面，TXNIP 可 降低GLUT1 mRNA 表達(dá)，抑制其轉(zhuǎn)錄[9,11]。③TXNIP 促進(jìn)脂類物質(zhì)合成代謝。在TXNIP 敲除的小鼠血液中，甘油三酯、脂肪酸等脂類物質(zhì)的含量顯著增加，血糖濃度下降[8,12]。由此可見，TXNIP 作為細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌基因，可通過調(diào)控腫瘤代謝的方式抑制腫瘤的生存能力。

在本研究中，我們?cè)趷盒院谒亓瞿Ｐ椭凶C明了紫草素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)紫草素通過劑量依賴的方式上調(diào)TXNIP 基因mRNA 的表達(dá)，并導(dǎo)致TXNIP 蛋白表達(dá)增加，由此推測這可能是紫草素抑制黑素瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的重要原因。該研究對(duì)于拓展紫草素在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值，以及對(duì)其調(diào)控機(jī)制的解讀具有重要意義。