二甲雙胍對人膀胱癌細胞能量代謝的調(diào)控作用分析

李慧瑾，陳葳

1. 陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，西安醫(yī)學院 基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所，陜西 西安710021；2. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安710061

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年新增的膀胱癌患者多于33 萬例，死亡病例多于3 萬例。膀胱癌的發(fā)病率有明顯的性別差異，男性與女性患者的比例約為3.8∶1[1]。在不同的國家和地區(qū)，膀胱癌的發(fā)病率不盡相同，其中以西班牙發(fā)病率最高。在我國，膀胱癌發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中居于首位，且呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類的健康和生命[2-3]。近年來有研究報道，二甲雙胍有抑制腫瘤生長的作用[4-7]，但關(guān)于二甲雙胍在膀胱癌能量代謝方面的作用機制研究較少，作用機制尚未闡明。關(guān)于腫瘤細胞的代謝研究最早由Warburg 提出，他發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細胞即使在有氧條件下仍選擇糖酵解途徑為其提供能量和生物合成原料[8]。事實上，腫瘤細胞的代謝平衡調(diào)節(jié)的復雜程度已遠遠超出Warburg 當初的設(shè)想[9]。腫瘤細胞代謝異常并非由單一的代謝通路簡單調(diào)控，而是細胞中整個代謝網(wǎng)絡(luò)的錯綜復雜的改變，包括糖酵解和線粒體代謝等在內(nèi)的整個代謝網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)變。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是糖酵解最后一步的限速酶，參與多種腫瘤細胞的有氧糖酵解[10-11]。HK2可通過N 端結(jié)合結(jié)構(gòu)域錨定到電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）蛋白上而定位于線粒體[12]。研究表明，VDAC 和HK2 的結(jié)合可通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的形成發(fā)揮抑制細胞凋亡的功能[13-14]。我們將分析不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤糖酵解和線粒體代謝的作用及其機制，為進一步明確二甲雙胍抑制腫瘤的作用機制提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱腫瘤細胞UMUC2 和5637（用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)）由實驗室保存；二甲雙胍粉末購自北京索萊寶公司；1640 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Fast200 RNA 提取試劑盒購自上海飛捷公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo 公司；SYBR greenⅡ購自TaKaRa 公司；CCK8 檢測試劑盒購自上海七海復泰公司；一抗（HK2、VDAC、p-STAT3 和βactin）和HRP 標記的二抗均購自CST 公司；引物由上海生工公司合成。

1.2 葡萄糖檢測

按照3×105/孔將細胞接種至6 孔板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液收集到EP管中，以初始細胞培養(yǎng)液葡萄糖量作為本底值，消化細胞后計數(shù)，檢測液為樣本0.01 mL 加工作液1 mL。將反應液混勻后37℃水浴15 min，按100 μL/孔加至96 孔板，測定D505nm值。樣本中葡萄糖含量=（測定D值-空白D值）×標準品濃度×樣本測試前稀釋濃度/（標準D值-空白D值）。結(jié)果用細胞數(shù)進行校正。

1.3 乳酸檢測

按照3×105/孔將細胞接種至6 孔板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液收集到EP管中，以初始細胞培養(yǎng)液乳酸量作為本底值，消化細胞后計數(shù)，檢測液包括樣本0.02 mL、酶工作液1 mL、顯色液0.2 mL。將反應液混勻后37℃水浴10 min，加入終止液2 mL 混勻，按100 μL/孔加至96 孔板，測定D530nm值。樣本中乳酸含量=（測定D值-空白D值）×標準品濃度×樣本測試前稀釋濃度/（標準D值-空白D值）。結(jié)果用細胞數(shù)進行校正。

1.4 ATP檢測

6 孔板每孔加入200 μL ATP 檢測裂解液裂解，4℃、12 000 r/min 離心5 min，收獲上清待檢測。按照1∶5 的比例用ATP 檢測稀釋液稀釋ATP檢測試劑，在檢測管中加入20 μL 樣品，按每個樣品加入100 μL ATP 檢測工作液到檢測管內(nèi)，室溫避光靜置3～5 min，迅速混勻，用Luminometer儀測定RLU 值。為消除細胞數(shù)量不同造成的差異，通過BCA 蛋白定量法對樣品制備過程中收獲的上清中的總蛋白進行濃度測定，將ATP 濃度換成nmol/（L·μg）蛋白的形式定量。

1.5 細胞膜電位檢測

用mitoTracker Red CMXRos 紅色熒光探針檢測細胞膜電位變化。配制1 mmol/L 的mitoTracker Red CMXRos工作液，用94 μL DMSO 溶 解50 μg 粉末即得。將細胞于24 孔板中常規(guī)培養(yǎng)，加入二甲雙胍48～72 h，細胞匯合度50%左右時加入37℃預熱的mitoTracker Red CMXRos 工作液（50 nmol/L），靜置孵育30 min；用培養(yǎng)基洗滌細胞2 次，甲醇室溫固定15 min；用PBS 洗滌細胞3次，每次2 min；收集細胞，酶標儀測定紅色熒光強度。

1.6 RNA提取及real-time PCR

用Fast200 RNA 提取試劑盒提取總RNA，用NanoDrop 測定RNA 濃度。取1 μg RNA，用Revert Aid 第一鏈cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA。合成目的基因特異性上下游引物，以cDNA 為模板擴增（擴增條件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)），β-actin為內(nèi)參。VDAC、HK2 和β-actin 的real-time PCR 鑒定引物見表1。

表1 real-time PCR 鑒定引物信息

1.7 Western印跡檢測蛋白表達水平

二甲雙胍處理細胞后，用RIPA 裂解液裂解細胞（1 mmol/L PMSF，1%蛋白酶雞尾酒抑制劑），冰上裂解30 min 后離心，上清即為獲得的蛋白。用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，進行12% SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜（240 mA，1 h），用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h；用VDAC、HK2、磷酸化信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）和β-actin 一抗4℃孵育過夜，TBST 洗滌5 次，每次8 min；用HRP 標記的羊抗兔或羊抗鼠的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌5 次，每次8 min；加入ECL 發(fā)光液，在化學發(fā)光儀上顯影，根據(jù)條帶的強弱比較蛋白表達水平的變化。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均用x±s表示，用SPSS18.0 和Graph-PadPrism software version 5.0軟件進行分析。2 組之間的差異比較采用兩樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞葡萄糖消耗的影響

檢測不同濃度的二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞UMUC2 和5637 中葡萄糖消耗的水平，發(fā)現(xiàn)當二甲雙胍濃度為20 mmol/L 時2 種細胞的葡萄糖濃度最低，隨著二甲雙胍濃度的升高，細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度升高。在UMUC2 細胞中，隨著二甲雙胍濃度升高，葡萄糖升高具有顯著性差異，即隨著二甲雙胍濃度的升高葡萄糖消耗減少。結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞葡萄糖消耗的影響

2.2 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞乳酸水平的影響

檢測了不同濃度的二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞UMUC2 和5637 中乳酸消耗的水平，發(fā)現(xiàn)2 種細胞中的乳酸水平保持不變，即隨著二甲雙胍濃度的升高乳酸消耗無顯著變化。結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞乳酸水平的影響

2.3 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞ATP 含量的影響

線粒體是有氧呼吸的主要場所，我們檢測了ATP 含量的變化。用不同濃度的二甲雙胍處理膀胱腫瘤細胞UMUC2 和5637，發(fā)現(xiàn)2 種細胞的ATP含量隨著二甲雙胍濃度的升高而逐漸下降。結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞ATP 含量的影響

2.4 二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞線粒體膜電位的影響

為進一步分析不同濃度二甲雙胍對人膀胱腫瘤細胞活力調(diào)控的機制，我們檢測了不同濃度的二甲雙胍對UMUC2 和5637 細胞線粒體膜電位的影響。mitoTracker Red CMXRos 可直接聚集在有活性的線粒體上，紅色熒光的強度反映線粒體的活性。將二甲雙胍加入膀胱腫瘤細胞作用48 h 后，對線粒體活性進行熒光檢測。結(jié)果顯示，20 mmol/L 的二甲雙胍能明顯降低細胞線粒體的活性，而在40 和60 mmol/L 二甲雙胍作用下，細胞線粒體活性相比對照組未見降低反而有升高趨勢（圖4）。

圖4 不同濃度二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞線粒體膜電位的影響

圖5 線粒體相關(guān)基因的mRNA（A）和蛋白表達（B）水平

2.5 線粒體相關(guān)基因表達

VDAC 的主要作用是保持線粒體外膜通透性，HK2 是糖酵解途徑的最終關(guān)鍵酶，并且其表達受STAT3 的調(diào)控。我們檢測了VDAC 和HK2 的RNA 和蛋白表達水平、p-STAT3 的蛋白表達水平。real-time PCR 結(jié)果顯示（圖5A），相比對照組，不同濃度的二甲雙胍處理組的VDAC 和HK2的mRNA 表達水平逐漸下降，其中40 和60 mmol/L 二甲雙胍對VDAC 和HK2 的mRNA 表達水平抑制更明顯。Western 印跡表明（圖5B），加入二甲雙胍可明顯降低VDAC、p-STAT3 和HK2 的表達，60 mmol/L 二甲雙胍的抑制效果最明顯。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，每年有超過430 000 例新發(fā)膀胱癌患者。2018 年僅美國的新發(fā)病例為81 890 例，死亡病例為17 240 例[15]。在我國，膀胱癌的發(fā)病率居于泌尿系統(tǒng)首位，且呈逐年上升趨勢。近年來，雖然膀胱癌通過手術(shù)結(jié)合放療和化療的綜合治療已獲得較好控制，但其復發(fā)率高且具有肌肉侵襲性特征，導致其治療效果無法令人滿意。因此，積極探究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找合理有效的診斷監(jiān)測標志物及新的治療靶點，具有重要意義。二甲雙胍最早用于降血糖治療，但近年來研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制多種腫瘤進展，但其具體機制尚須闡明。本研究中，我們檢測了不同濃度的二甲雙胍對膀胱腫瘤細胞的葡萄糖含量、乳糖水平、ATP 水平及細胞膜電位的影響，結(jié)果提示二甲雙胍可以通過抑制糖酵解和線粒體功能發(fā)揮對膀胱腫瘤的抑制作用。為了進一步檢測其具體的作用機制，我們檢測了HK2、VDAC 和p-STAT3 的表達，結(jié)果提示二甲雙胍可以通過降低HK2、VDAC 和p-STAT3 的表達來發(fā)揮作用。綜上所述，本研究提示二甲雙胍可能通過抑制HK2、VDAC 和p-STAT3 的表達來阻斷膀胱腫瘤的糖酵解和線粒體功能，為研究二甲雙胍對腫瘤的抑制作用機制奠定了理論基礎(chǔ)并提供了實驗依據(jù)。