張飛飛，孫文，耿琦，丁怡彤

徐州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院，江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇 徐州221004

慢病毒載體是以人免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，與傳統(tǒng)的病毒載體相比，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力[1-2]，具有自我失活功能，是無免疫反應(yīng)的高效基因傳遞工具，容納的外源基因片段大、宿主范圍廣、重組機會低，可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長期表達(dá)[3-4]，隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代，是目前應(yīng)用最廣泛的基因運載工具之一，已用于轉(zhuǎn)基因動物的制備和基因治療研究中。

通常用病毒滴度來衡量慢病毒制備是否成功以及慢病毒的質(zhì)量，因此滴度測定是一個重要的步驟，尤其是用于基因治療或轉(zhuǎn)基因動物研制等需要準(zhǔn)確測定滴度的重組慢病毒。目前測定慢病毒滴度的主要方法有流式細(xì)胞分選法（FACS）[5-6]和p24 蛋白酶聯(lián)免疫法（ELISA）[7-8]。通過流式細(xì)胞儀檢測靶細(xì)胞中被感染的細(xì)胞的比例，能準(zhǔn)確反映病毒滴度以及病毒的實際感染活力，但所需設(shè)備昂貴，而且僅限于表達(dá)熒光報告基因的慢病毒載體。p24 蛋白ELISA 法檢測的是病毒的物理單位，即不能區(qū)分具有感染能力和不具有感染能力的病毒顆粒，并不能反映病毒的真實感染活力，因此該方法的應(yīng)用也受限制。鑒于此，建立一種特異、靈敏、有效的慢病毒滴度分子檢測方法，可為慢病毒的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

在《分子克隆實驗手冊》提供的慢病毒載體測定方法基礎(chǔ)上[9]，本文介紹一種利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定慢病毒滴度的方法。該方法通過設(shè)計定量引物檢測WPRE 序列（WPRE序列是重組慢病毒中常見的調(diào)控元件，且在正常情況下不存在于動物細(xì)胞體內(nèi)，因此可以作為重組慢病毒插入靶細(xì)胞基因組后的一個定量檢測標(biāo)志物），同時選擇人源性的單拷貝基因白蛋白（albumin，Alb）基因作為內(nèi)參基因[10-11]，最終計算得到每個細(xì)胞整合的慢病毒拷貝數(shù)。該方法檢測到的是感染了細(xì)胞并成功整合的病毒，能體現(xiàn)出病毒的真實感染活力，且不受細(xì)胞基因組DNA提取效率影響，另外熒光標(biāo)簽的有無對滴度檢測沒有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；大腸桿菌DH5α、Stbl3，克隆質(zhì)粒pBluescript SK（+），包膜質(zhì)粒pMD2.G，包裝質(zhì)粒psPAX2，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLentiCRISPR V2 均為本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker 及SYBR Green 熒光染料購自大連寶生物公司；無內(nèi)毒素大提試劑盒和細(xì)胞基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（0.25% Trypsin-EDTA）、LipofectAMINE 2000、OPTI-MEM 和DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；PCR引物合成及測序由蘇州金唯智公司完成；實時熒光定量PCR 儀為Roche 公司的LightCycler 480II；超速離心機為Beckman Coulter 公司的Optima L-100XP；核酸濃度測定儀為Thermo Scientific 公司的NanoDrop 2000；真空離心濃縮儀為Genevac 公司的miVac Duo；生物安全柜為Heal Force 公司的HFsafe-1200LCB2。

1.2 分子生物學(xué)常規(guī)操作

大腸桿菌的培養(yǎng)、PCR 擴增、質(zhì)粒提取和酶切鑒定等實驗參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。本研究所用PCR引物序列見表1。

表1 本研究所用PCR引物

1.3 WPRE 元件和Alb 基因的質(zhì)粒構(gòu)建

以pLentiCRISPR V2 質(zhì)粒為模板、WPRE F1和WPRE R1為引物，擴增出588 bp 的WPRE 序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ酶切后，克隆到pBluescript SK（+）的相同位點，經(jīng)酶切和測序驗證后命名為pSK-WPRE。以HEK293T 細(xì)胞基因組DNA 為模板、Alb F1 和Alb R1 為引物，擴增出142 bp 的Alb 基因序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后克隆至pBluescript SK（+）/BamHⅠ-XhoⅠ獲得pSK-Alb，酶切鑒定并測序。

1.4 計算標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)

根據(jù)公式①計算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù):

其中，A為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的質(zhì)量（ng），N為阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023，M為標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量（標(biāo)準(zhǔn)品的堿基對數(shù)×1 對堿基的平均相對分子質(zhì)量660）。

pSK-WPRE 質(zhì)粒大小為3540 bp，濃度為500 ng/μL，計算pSK-WPRE 的拷貝數(shù)為1.29×1011拷貝/μL。同理，pSK-Alb（3055 bp，500 ng/μL）的拷貝數(shù)為1.49×1011拷貝/μL。最終稀釋獲得拷貝數(shù)分別為1.25×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103拷貝/μL 的4 個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。

1.5 慢病毒的包裝

1.5.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒收集 采用LipofectAMINE 2000 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h，將293T 細(xì)胞以5×106/10 cm 培養(yǎng)皿密度接種，加入10 mL 293T 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到80%～90%。培養(yǎng)6 h后棄去含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，PBS 清洗一次，加入含10%血清的新鮮完全培養(yǎng)基，分別于24、48、72 h 收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清培養(yǎng)液。

按照如下反應(yīng)體系配置:22.5 μg pLenti-CRISPR V2，16.9 μg psPAX2，5.6 μg pMD2.G，加 OPTI- MEM補至500 μL；125 μL LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑，375 μL OPTI-MEM，總體積500 μL。

1.5.2 慢病毒濃縮和純化 將收集的293T 細(xì)胞上清液于4℃、4000 r/min 離心10 min，去除細(xì)胞碎片，用0.45 μm 的過濾器過濾，獲得的上清液于4℃、82 700 r/min 超速離心2 h，棄上清，加入PBS，輕輕反復(fù)吹打重懸，充分溶解后分裝。

1.6 慢病毒感染293T 細(xì)胞

檢測前1 d 將293T 細(xì)胞傳代，24 孔板中每孔加入2.5×104細(xì)胞，體積為500 μL；根據(jù)病毒的預(yù)期滴度準(zhǔn)備3 個無菌EP 管，每管加入90 μL 培養(yǎng)基（10% FBS+DMEM）；取待測定的病毒原液10 μL 加入第1 管，混勻后取10 μL 加入第2 管，繼續(xù)相同操作到第3 管；選取所需細(xì)胞孔，移除培養(yǎng)基并用PBS 清洗，加入90 μL 病毒稀釋液、410 μL 生長培養(yǎng)基和5 μg/μL Polybrene 進(jìn)行培養(yǎng)；感染24 h 后移除含病毒的培養(yǎng)基，換為500 μL含DNaseⅠ的新鮮培養(yǎng)基，37℃消化15 min（這一步是要除去慢病毒懸浮液里殘余的質(zhì)粒DNA，防止影響后續(xù)慢病毒滴度測定），然后加入新鮮的生長培養(yǎng)基，小心操作，不要吹起細(xì)胞；2～3 d 后，抽提基因組DNA。

1.7 實時熒光定量PCR

反 應(yīng) 體系包括SYBR Green master（2×）10 μL，上、下游引物（WPRE F2-WPRE R2 或Alb F2-Alb R2，10 μmol/L）各1 μL，基因組DNA 模板100 ng 或104～107拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品8 μL，補水至20 μL。擴增程序:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退 火30 s，循環(huán)40 次。熔 解 曲線 程 序:95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃，1 次循環(huán)，退火延伸時檢測熒光信號。每個樣品做2 個重復(fù)，同一個樣品進(jìn)行3 次獨立的熒光定量PCR 檢測。

1.8 慢病毒滴度計算方法

分別以慢病毒感染的細(xì)胞基因組和104～107拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行定量PCR，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct 值和拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得待測樣品的WPRE和Alb 的拷貝數(shù)。根據(jù)公式②計算得到每個細(xì)胞整合的慢病毒拷貝數(shù)，最后根據(jù)公式③算得慢病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pSK-WPRE 和pSK-Alb 分別經(jīng)BamHⅠ/XbaⅠ和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖1，均與預(yù)期大小一致，表明標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取4 個不同稀釋比例（104～107拷貝）的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，獲得的擴增動力學(xué)曲線圖如圖2A。根據(jù)擴增曲線圖，軟件分別生成pSK-WPRE 和pSK-Alb 質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2B），回歸方程分別為y=-4.255x+46.047 和y=-2.8735x+35.831，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明在標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒4 個不同稀釋比例范圍內(nèi)具有非常好的線性關(guān)系，擴增效率E均大于95%。最終擴增產(chǎn)物的熔解曲線如圖2C，波峰單一，表明PCR 產(chǎn)物特異性較好，另外波峰的高度與標(biāo)準(zhǔn)品DNA 的拷貝數(shù)呈正相關(guān)。

圖2 實時熒光定量PCR 檢測pSK-WPRE 和pSK-Alb 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒

2.3 實時熒光定量PCR 檢測慢病毒整合拷貝數(shù)并計算慢病毒滴度

根據(jù)1.5 的操作流程包裝慢病毒，獲得的慢病毒按照1.6 所述方法稀釋，分別獲得體積為10、1、0.1 μL 的慢病毒稀釋液，感染293T 細(xì)胞2 d后，提取細(xì)胞基因組DNA，應(yīng)用RT-qPCR 檢測不同稀釋比例的慢病毒感染的細(xì)胞基因組DNA 中WPRE 整合拷貝數(shù)，結(jié)果見表2，最終的慢病毒滴度為（4.3±0.9）×106TU/mL。

3 討論

慢病毒載體是近年出現(xiàn)的一種新的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，由于其具有可以長期、穩(wěn)定、高水平地表達(dá)，感染效率高，自身抗原性弱，可操控性強等優(yōu)點，被應(yīng)用于細(xì)胞和動物模型建立[13-14]以及基因治療[15-16]等領(lǐng)域。

表2 定量PCR法測定慢病毒滴度

高滴度慢病毒的包裝受很多因素的影響，經(jīng)過多次的包裝實驗，本課題組總結(jié)獲得高滴度慢病毒的關(guān)鍵在于:①保障包裝細(xì)胞系HEK293T 的質(zhì)量，傳代次數(shù)盡可能少；②轉(zhuǎn)染時合適的細(xì)胞融合率，細(xì)胞量過少不容易包裝出病毒，過大則細(xì)胞會在病毒收集前因為接觸抑制而大量死亡，也不容易包裝出病毒，最佳細(xì)胞融合率為60%～70%；③不含內(nèi)毒素的包裝質(zhì)粒濃度大于500 ng/μL，且D260nm/D280nm＞1.8，D260nm/D230nm＞1.8；④轉(zhuǎn) 染 后24、48 和72 h 分3 次收集病毒上清，采用超速離心方法進(jìn)行慢病毒濃縮。

高滴度的慢病毒是其實現(xiàn)高效基因傳遞的基礎(chǔ)，所以準(zhǔn)確測定慢病毒滴度尤為重要。已有文獻(xiàn)報道利用RT-qPCR 方法檢測慢病毒滴度。Sanburn 等[17]采用測定慢病毒懸浮液中的RNA 水平方法，但往往由于缺陷的病毒顆粒導(dǎo)致過高評估慢病毒滴度。Lizee 等[11]通過檢測慢病毒侵染細(xì)胞的mRNA 水平，但有時慢病毒的功能原件很有可能整合到不適合基因轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)域，從而低估了慢病毒滴度。這2 種方法均涉及到RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄過程，存在操作復(fù)雜及重復(fù)性差等問題。本研究所闡述的基于SYBR Green 的實時熒光定量PCR，是以被病毒侵染的細(xì)胞基因組DNA 為模板，首先體外DNA 比RNA 更加穩(wěn)定，其次基因組DNA 的提取更加方便快捷。

和基于熒光探針的定量PCR 測定慢病毒滴度的結(jié)果相類似[18]，本研究基于SYBR Green 的定量PCR 方法的擴增效率接近100%，熔解曲線分析無引物二聚體。

最終我們只獲得滴度為106數(shù)量級的慢病毒，和商品化方法獲得108甚至109數(shù)量級的慢病毒還相差甚遠(yuǎn)。我們猜測pLentiCRISPR V2 慢病毒載體上5'長末端重復(fù)序列（LTR）和3'LTR 之間有將近10 kb 的病毒調(diào)控元件和Cas9 基因，如此長的片段導(dǎo)致其包裝效率和感染力比一般慢病毒低。但總的來說，本方法成本低、操作簡便快捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，為重組慢病毒應(yīng)用于臨床基因治療和CRISPR-screening 等需要準(zhǔn)確慢病毒滴度的相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。