一種具有G418抗性篩選標(biāo)記的慢病毒RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用

趙思捷，朱文琦，孫杰，侯俊，王友亮，李永利，李波，鮑春梅，張浩，李伯安

1. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，北京100039；2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，闡明候選基因在個(gè)體發(fā)育、遺傳變異、腫瘤等重大疾病發(fā)生過程中的作用成為研究的重點(diǎn)，通過向特定細(xì)胞或組織遞送調(diào)控候選基因表達(dá)的載體來改變其表達(dá)水平并檢測(cè)后續(xù)信號(hào)通路或生物性狀的改變，是研究候選基因功能的一種重要手段。表達(dá)載體既可以以質(zhì)粒的形式轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以通過包裝成假病毒的形式感染目的細(xì)胞。一些細(xì)胞如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、非分裂期的細(xì)胞以及分化的細(xì)胞用常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法效率比較低，而將含有病毒包裝元件的表達(dá)載體包裝成病毒后再感染目的細(xì)胞可以克服上述困難，因而成為基因功能研究的更有效、更通用的方法[1-2]。

常見的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體，它們可以和輔助包裝質(zhì)粒在包裝細(xì)胞中包裝成復(fù)制缺陷的假病毒，有效感染靶細(xì)胞。但是，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂的細(xì)胞[3-4]，而腺病毒載體不能整合入宿主的基因組DNA 因而不能實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的長(zhǎng)久持續(xù)性調(diào)控[5-6]，因此慢病毒表達(dá)載體成為實(shí)驗(yàn)室有效的常規(guī)研究工具[7-10]。慢病毒載體有基因過表達(dá)載體以及將特定基因表達(dá)水平敲低的載體（包括RNA干擾載體和基因編輯CRISPR/Cas9 載體等），它們大多含有嘌呤霉素篩選標(biāo)記基因，可以篩選出基因組中整合有表達(dá)載體序列的細(xì)胞。但在實(shí)驗(yàn)中為排除RNA 干擾序列的非靶效應(yīng)，經(jīng)常需要先在細(xì)胞中敲低某一基因的表達(dá)，隨后再進(jìn)行回復(fù)突變進(jìn)行功能驗(yàn)證；或者在細(xì)胞中先將目的基因過表達(dá)后再進(jìn)行RNA 干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能確證，這往往需要過表達(dá)載體與敲低載體有2 種不同的抗生素篩選標(biāo)記基因[11-13]。

本研究中，我們對(duì)RNA 干擾載體pLKO-puro進(jìn)行了改構(gòu)，首先在該載體骨架中切除嘌呤霉素抗性基因編碼片段，然后從pcDNA3.0 載體中擴(kuò)增新霉素抗性基因并插入酶切后的載體片段中，并將改構(gòu)的RNA 干擾載體包裝成慢病毒后感染肝癌細(xì)胞HepG2，檢測(cè)感染細(xì)胞對(duì)G418 的抵抗作用。為驗(yàn)證改構(gòu)RNA 干擾載體的有效性，設(shè)計(jì)了2 條針對(duì)乙型肝炎病毒x基因（hepatitis B virusxgene，HBx）的RNA 干擾序列以及針對(duì)螢光素酶cDNA 的對(duì)照干擾序列并插入該載體，將含G418篩選標(biāo)記的HBx 的RNA 干擾載體與輔助質(zhì)粒在293T 細(xì)胞中包裝成慢病毒，感染過表達(dá)HBx 的HepG2（嘌呤霉素抗性）細(xì)胞，G418 篩選出穩(wěn)定混合克隆，提取細(xì)胞總RNA，用RT-qPCR 方法檢測(cè)其在HepG2 細(xì)胞中對(duì)HBx RNA 表達(dá)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

過表達(dá)HBx 蛋白的人肝癌細(xì)胞系HepG2-X由本中心實(shí)驗(yàn)室建立；人胚胎腎細(xì)胞293T，質(zhì)粒pcDNA3.0、pLKO-puro 及慢病毒包裝質(zhì)粒psAX2、pMD2G 由本中心實(shí)驗(yàn)室保存；含HBx cDNA 編碼序列的質(zhì)粒pADR 由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所王友亮研究員饋贈(zèng)；ExTaq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、KpnⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；胎牛血清購(gòu) 自BIOWEST 公 司；DMEM 購(gòu) 自Hyclone 公 司；G418 購(gòu)自Amresco 公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化有限公司產(chǎn)品；定量PCR 反應(yīng)試劑盒為Genstar 公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 pLKO-neo 的構(gòu)建

首先從pcDNA3.0 載體中擴(kuò)增G418 抗性基因DNA 片段，上游引物為5'-CGCGGATCCACCGGA GCTTACCATGATTGAACAAGATGGATTGC-3',下游引物為5'-TTCGGTCGGGCGCTGCGGGTCGTGGGGCGGGCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'（下游引物序列中含有原載體pLKO-puro 部分骨架序列）；接著以上述PCR 產(chǎn)物為模板，用上述上游引物和下游引物5'-CGGGGTACCGATGCATGGGGT CGTGCGCTCCTTTCGGTCGGGCGCTGC-3'進(jìn)行第2輪PCR 擴(kuò)增，通過第2 輪PCR 在新霉素抗性基因終止密碼子和KpnⅠ酶切位點(diǎn)中間補(bǔ)充全部的原載體骨架序列。PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切并純化；pLKO-puro 載體也進(jìn)行相同的雙酶切，酶切后回收載體片段并與上述PCR 酶切片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切分析和DNA 測(cè)序。

1.3 慢病毒的包裝及感染

參見文獻(xiàn)[14]。

1.4 螢光素酶shRNA 和HBx shRNA 的設(shè)計(jì)及克隆

在線設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）（www.protocol-online.org），選擇分值較高的序列，插入如下下劃線的對(duì)應(yīng)模塊序列中，將合成后的引物退火后，與經(jīng)AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切的pLKO-neo 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

下劃線序列為引物合成模塊的固定序列，合成不同靶位點(diǎn)的shRNA 序列時(shí)，只須將21 bp 的靶序列及其互補(bǔ)序列分別插入未劃線部分即可。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)HBx mRNA 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

用TRIzol 法分別提取穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照螢光素酶shRNA 以 及2 條HBx shRNA 的HepG2細(xì)胞的總RNA，取0.5 μg 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并稀釋至1/5 后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。用于檢測(cè)HBx 的正向引物為5'-CAGCAATGTCAACGACCGAC-3'，反向引物為5'-ATGCCTACAGCCTCCCAGTA-3'；用于檢測(cè)β-actin 的正向引物為5'-CATGTACGTT GCTATCCAGGC-3'，反向引物為5'-CTCCTTAAT GTCACGCACGAT-3'。通過各自的Ct 值計(jì)算出HBx 敲低后其mRNA 在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 pLKO-neo shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建

首先以pcDNA3.0 載體為模板，根據(jù)新霉素基因DNA 編碼序列擴(kuò)增出840 bp 的DNA 片段，同時(shí)為保持改構(gòu)后的載體與原載體骨架序列的一致性，又根據(jù)pLKO-puro 載體中嘌呤霉素編碼區(qū)下游和KpnⅠ識(shí)別序列上游的載體DNA 序列，將第1 輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行新一輪PCR 重疊延伸反應(yīng)，擴(kuò)增出870 bp 的DNA 片段（圖1A），最終PCR 產(chǎn)物純化后，用BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切并純化；將pLKO-puro 載體進(jìn)行相同的雙酶切，酶切后回收8.2 kb 的載體片段并與上述PCR 酶切片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖1B），pLKO-puro 載體經(jīng)BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切后得到8.2 kb 的載體片段和670 bp 的嘌呤霉素抗性基因片段，改構(gòu)后的pLKO-neo 載體經(jīng)BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切后分別得到8.2 kb 的載體片段和900 bp 左右的新霉素抗性基因片段，提示載體已得到成功改構(gòu)，進(jìn)一步進(jìn)行DNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒中含有編碼完整新霉素抗性基因（結(jié)果略）。

2.2 感染pLKO-neo 表達(dá)載體HepG2 對(duì)G418 篩選的抗性

HepG2 未感染及感染pLKO-neo 包裝的慢病毒后48 h，分別用400、600、800 及1000 g/mL 的G418 處理細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞存活狀況并照相。未感染組細(xì)胞處理8 d 后，所有G418 處理組的細(xì)胞均大量死亡，且隨著G418 濃度提高，細(xì)胞死亡程度依次增加，800 g/mL G418 處理組仍有少量細(xì)胞貼壁存活，而1000 g/mL G418 處理組細(xì)胞全部死亡，見不到貼壁且為上皮狀形態(tài)的細(xì)胞。感染pLKO-neo 包裝的慢病毒組細(xì)胞在G418處理后雖有細(xì)胞死亡，但仍有大量細(xì)胞貼壁存活并增殖，至G418 處理后的第8 d，抵抗高濃度（800 和1000 g/mL）G418 的細(xì)胞混合克隆均生長(zhǎng)至鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板，表明克隆入慢病毒表達(dá)載體的新霉素抗性基因在感染細(xì)胞中得到了表達(dá)且具有對(duì)G418 的抵抗作用，提示構(gòu)建的重組載體pLKO-neo 包裝為慢病毒感染細(xì)胞后可用于快速、高效篩選出G418 抗性的細(xì)胞克隆。

2.3 對(duì)照螢光素酶shRNA 及HBx shRNA 的表達(dá)

為進(jìn)一步探索改構(gòu)載體在RNA 干擾中的應(yīng)用價(jià)值，設(shè)計(jì)了針對(duì)HBx 蛋白編碼區(qū)的21 bp 的2條RNA 干擾序列，同時(shí)設(shè)計(jì)了1 條針對(duì)螢光素酶的RNA 干擾序列，按照pLKO RNA 干擾序列的合成模塊合成（參見材料與方法）。將其與互補(bǔ)鏈退火后，與經(jīng)AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切的pLKO-neo 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的RNA 干擾序列均正確克隆入載體pLKO-neo 中（結(jié)果略）。

2.4 HBx shRNA 序列對(duì)HBx 表達(dá)的抑制作用

為檢測(cè)設(shè)計(jì)的HBx shRNA 對(duì)HBx 表達(dá)的抑制效果，首先在293T 細(xì)胞中將含有螢光素酶及HBx shRNA 序列的慢病毒表達(dá)載體pLKO-neo 包裝成慢病毒，在穩(wěn)定過表達(dá)HBx 的人肝癌HepG2-X 細(xì)胞中分別感染上述3 種慢病毒，同時(shí)設(shè)1 孔未感染細(xì)胞做對(duì)照，經(jīng)G418 篩選1 周后對(duì)照細(xì)胞全部死亡，而感染組有大量存活細(xì)胞，G418 抗性細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)、傳代后，分別提取細(xì)胞總RNA 進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，結(jié)果見圖3，與穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶shRNA 的對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)HBx shRNA的感染組細(xì)胞中HBx mRNA 水平均顯著降低。

圖1 pLKO-neo 載體的構(gòu)建

3 討論

本研究構(gòu)建了帶有G418 篩選標(biāo)記的RNA 干擾慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)慢病毒包裝并感染肝癌細(xì)胞后，用合適濃度的G418 篩選獲得基因組穩(wěn)定整合該載體的細(xì)胞株；將針對(duì)HBx 編碼序列的RNA干擾序列插入該載體，將其包裝成慢病毒導(dǎo)入高表達(dá)HBx 的肝癌細(xì)胞HepG2-X 中，能顯著降低HBx mRNA 的表達(dá)水平。這表明該載體可與具有嘌呤霉素篩選標(biāo)記基因過表達(dá)載體聯(lián)合使用:可以先建立候選基因穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，再運(yùn)用該載體降低候選基因mRNA 表達(dá)水平；也可以先用該載體抑制候選基因的表達(dá)，再進(jìn)行回復(fù)突變功能分析以確證候選基因功能。由于慢病毒感染效率高，感染后載體可整合到靶細(xì)胞中，應(yīng)用G418 篩選，1 周后即可獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因shRNA 的細(xì)胞克隆。

圖2 感染pLKO-neo 載體包裝的慢病毒的HepG2 細(xì)胞對(duì)G418 的抵抗作用

圖3 HBx shRNA 對(duì)HBx mRNA 表達(dá)的抑制作用

在用抗生素篩選外源載體穩(wěn)定整合細(xì)胞的過程中，如已經(jīng)獲得具有嘌呤霉素抗性細(xì)胞，再篩選G418 抗性細(xì)胞時(shí)，2 種抗生素聯(lián)合使用會(huì)造成慢病毒感染組細(xì)胞的大量死亡，很難獲得穩(wěn)定的感染細(xì)胞。此時(shí)，可先不用嘌呤霉素而僅用合適濃度的G418 處理細(xì)胞（不同細(xì)胞對(duì)G418 的敏感性不同，正式篩選穩(wěn)定細(xì)胞克隆之前須先用不同濃度的G418 處理細(xì)胞，找出在8 d 左右導(dǎo)致所有細(xì)胞死亡的最低濃度作為合適的篩選濃度），待篩選出抗G418 穩(wěn)定克隆后再補(bǔ)加嘌呤霉素處理，以維持具有2 種抗生素抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)。

大量研究表明HBx 在肝癌發(fā)生中通過影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤微環(huán)境的改變而發(fā)揮重要作用[15-16]，HBx 也能通過腫瘤細(xì)胞抑制機(jī)體免疫功能，但相關(guān)研究較少[17]。本研究在肝癌細(xì)胞中分別建立了HBx 過表達(dá)以及在HBx 過表達(dá)后敲低其表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，為深入探討HBx 調(diào)節(jié)宿主免疫功能奠定了基礎(chǔ)。