廖華勇，王 景，李紅玉

(廣州華鑫檢測技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663)

喹諾酮類藥物(Quinolones,QNs)是一類具有4-喹諾酮結(jié)構(gòu)的合成抗菌類藥物，因具有抗菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)、價格低、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，被廣泛用于由細(xì)菌和支原體引起的人和動物的疾病治療[1-2]。化妝品作為人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?，一直受到全世界人民的關(guān)注。特別是隨著生活水平的提高以及消費(fèi)能力的增強(qiáng)，越來越多的人群開始注重皮膚保養(yǎng)，這就對化妝品的質(zhì)量及功效提出了更高要求。然而，部分廠家為增強(qiáng)產(chǎn)品祛痘、除螨和抗粉刺的效果，在化妝品中添加喹諾酮類藥物。該類藥物可通過皮膚微血管和黏膜吸收，長期不當(dāng)或過量使用可能導(dǎo)致其在人體蓄積，進(jìn)而破壞皮膚表層菌群，導(dǎo)致皮疹、過敏和病原體產(chǎn)生抗藥性等損害。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[3]及歐盟化妝品法規(guī)(EC)No.1223/2009[4]均明確規(guī)定不得將抗生素類藥物作為化妝品的生產(chǎn)原料及添加組分。因此，建立一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的化妝品中喹諾酮類藥物的檢測方法對于保障化妝品質(zhì)量安全具有重要意義。

目前，喹諾酮類藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5]、膠體金免疫層析法(GICA)[6]、電化學(xué)法(EC)[7]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法(CE-ECL)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-15]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[16-18]等。由于化妝品種類多、基質(zhì)差異大，且違法添加的抗生素藥物含量低，這不僅要求樣品提取與凈化技術(shù)具有普適性和高效性，還要求測試方法具有良好的選擇性和高靈敏度。上述已報道的ELISA、EC、HPLC、LC-MS/MS等方法雖然可對喹諾酮類化合物進(jìn)行檢測，但在選擇性和陽性確證方面仍存在不足。HRMS具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點，抗干擾能力強(qiáng)，可適用于基質(zhì)復(fù)雜、待測物含量低的樣品分析。近年來，液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法越來越多地應(yīng)用于化妝品等復(fù)雜基質(zhì)中藥物和非法添加物質(zhì)的多組分分析[16-18]。本文采用簡單的正己烷液液萃取凈化結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q Orbitrap HRMS)，建立了一種同時測定水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品中17種喹諾酮類藥物的檢測方法。該方法操作簡單，定性定量分析準(zhǔn)確，適用于化妝品中喹諾酮類藥物的安全性評價分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀和Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國Caliper公司)；KQ-500E數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；KDC-1044離心機(jī)(中科佳儀有限公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；MS3渦旋儀(德國IKA公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、丹諾沙星、氟羅沙星、奧比沙星、麻保沙星、依諾沙星、洛美沙星、加替沙星、西諾沙星和那氟沙星，純度均大于98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；內(nèi)標(biāo)：D5-恩諾沙星(純度大于99%，德國Witega公司)；乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；超純水(18.2 MΩ·cm，由Millipore純水儀制備)。

樣品為隨機(jī)的市售水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

100 mg/L單標(biāo)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液(含1%甲酸)定容至刻度，-18 ℃儲存。

100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取各單標(biāo)儲備液0.25 mL于250 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液定容至刻度，使用前現(xiàn)配。

1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取D5-恩諾沙星10 mg于10 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液(含1%甲酸)定容至刻度，-18 ℃儲存。

1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確移取內(nèi)標(biāo)儲備溶液0.1 mL于100 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液定容至刻度，-18 ℃儲存。

1.3 樣品前處理

稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)，置于25 mL具塞比色管中，加入1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液0.1 mL，渦旋混勻，加入20 mL 0.1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，以0.1%甲酸乙腈溶液定容至25 mL，搖勻。移取2.0 mL上述提取液，經(jīng)10 000 r/min高速離心2 min后，準(zhǔn)確移取1.0 mL上清液于50 ℃水浴中氮吹至近干，用10%乙腈溶液定容至2.0 mL，加入2 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋振蕩1 min后，4 000 r/min離心2 min，下層清液經(jīng)聚四氟乙烯濾膜過濾后待測定。

1.4 檢測條件

液相色譜條件：Agilent Poroshell EC C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)色譜柱；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水，梯度洗脫條件：0.0～8.0 min，10%～30%A；8.0～8.1 min，30%～10%A；8.1～12.0 min，10%A；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧離子源(HESI)溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣壓力為 0.276 MPa，輔助氣流速為 3.3 L/min；全掃描/二級離子掃描(Full Scan/dd-MS2)模式:采集范圍為m/z100～600，正離子采集；一級質(zhì)譜分辨率為70 000 FWHM，二級質(zhì)譜分辨率為17 500 FWHM；歸一化碰撞能量(NCE)為17.5、35.0、52.5 eV。其他分析參數(shù)見表1。

表1 17種喹諾酮類藥物的分析參數(shù)Table 1 Analysis parameters of 17 quinolones

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇考察了Agilent Poroshell EC C18(4.6 mm×150 mm，2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)3種液相色譜柱對17種喹諾酮類化合物的分離效果。結(jié)果顯示：后2種色譜柱對目標(biāo)化合物的保留相對較差，色譜峰的半峰寬較寬，丹諾沙星、司帕沙星等部分化合物的峰形出現(xiàn)拖尾；而所有目標(biāo)化合物在Agilent Poroshell EC C18色譜柱上均能實現(xiàn)有效保留，且重現(xiàn)性好，因此選擇該色譜柱對樣品進(jìn)行分離。

2.1.2 流動相的選擇喹諾酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)為氧代喹啉羧酸，含有羧基和氮原子，因此在酸性條件下有利于形成[M+H]+峰。為增加化合物響應(yīng)，實驗所用流動相中均加入0.1%甲酸。首先選取0.1%甲酸乙腈為有機(jī)相，考察了0.1%甲酸水、5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)為水相時的分離效果。結(jié)果表明：0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)兩種水相下化合物的出峰響應(yīng)相差不大(5%以內(nèi))，但0.1%甲酸水條件下化合物的峰形對稱，因此選擇水相為0.1%甲酸水溶液，進(jìn)一步比較了0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇分別為有機(jī)相時的分離效果。結(jié)果顯示，兩種有機(jī)相下目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)和峰形相當(dāng)，但有機(jī)相為乙腈時，色譜柱柱壓低。為有效保護(hù)色譜柱，實驗最終選擇0.1%甲酸乙腈與0.1%甲酸水為流動相。在優(yōu)化條件下，17種喹諾酮類化合物的響應(yīng)和峰形均滿足分析要求(見圖1)。

圖1 喹諾酮類化合物的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of quinolones

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的優(yōu)化常用的化妝品樣品提取方式包括超聲萃取、渦旋振蕩和水平振蕩。由于膏霜類化妝品的黏度較大，在渦旋振蕩和水平振蕩過程中常出現(xiàn)分散不均勻現(xiàn)象。而超聲萃取法利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)來加速樣品中各組分的釋放，使其有效擴(kuò)散和溶解于提取溶劑中，從而顯著改善提取效果，適合于膏霜類化妝品的前處理。實驗考察了不同超聲時間(5、10、15、20、30 min)對加標(biāo)100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品中目標(biāo)物提取效率的影響，結(jié)果表明，隨著超聲時間的延長，目標(biāo)物的提取率逐漸增加，超聲時間為20 min時提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長超聲時間，提取率無顯著提高。因此，選擇超聲提取20 min。

2.2.2 提取溶劑的選擇由于喹諾酮類化合物易溶于有機(jī)溶劑，可采用乙腈進(jìn)行萃取?？紤]到不同化妝品的基質(zhì)特點，分別以不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈水溶液(100%、80%、50%、20%)作為提取溶劑，對加標(biāo)100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品進(jìn)行提取。結(jié)果顯示，提取溶劑中有機(jī)相比例≥80%時，17種化合物的提取回收率較高，可達(dá)80%以上。為便于后續(xù)氮吹濃縮，實驗選取100%乙腈為提取溶劑。此外，根據(jù)喹諾酮類化合物的pKa可知，其在酸性溶劑中溶解度更好，因此最終以0.1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.2.3 凈化方法的選擇喹諾酮類藥物的非法添加量一般較小，若提取液直接使用高分辨質(zhì)譜測定，則化妝品中含有的大量脂類和表面活性劑等物質(zhì)會對目標(biāo)化合物的檢測產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此需先對提取液進(jìn)行凈化。目前，化妝品的常用凈化方法有正己烷液液萃取脫脂、分散固相萃取凈化及固相萃取柱凈化等。實驗考察了HLB固相萃取柱、PSA+C18分散固相萃取以及正己烷液液萃取脫脂3種凈化方式對加標(biāo)100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品的提取效果。結(jié)果表明，選取HLB固相萃取柱凈化時，目標(biāo)化合物的回收率為80%～110%，但凈化步驟繁瑣，操作復(fù)雜；采用PSA+C18分散固相萃取和正己烷液液萃取脫脂凈化時，目標(biāo)化合物的回收率同樣能達(dá)到80%～110%，為節(jié)約成本和便于操作，最終選擇正己烷液液萃取脫脂凈化。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限本實驗以D5-恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法定量，以校正ESI離子源在檢測樣品時出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)。在優(yōu)化條件下，采用本方法分別測定質(zhì)量濃度為0.05～20.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中D5-恩諾沙星的質(zhì)量濃度為4.0 μg/L。以各化合物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)(x)，以化合物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，17種喹諾酮類化合物均在0.05～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.996 0(見表2)。

通過測定質(zhì)量濃度為1.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算得到各化合物的儀器檢出限(ILOD)和儀器定量下限(ILOQ)。結(jié)合前處理過程中的稀釋倍數(shù)(n)和回收率(R)，計算得到17種喹諾酮類化合物的方法檢出限(LOD=ILOD×n/R)和定量下限(LOQ=ILOQ×n/R)分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。

2.3.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在優(yōu)化條件下，選取2種基質(zhì)(爽膚水、面霜)的陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。每種基質(zhì)分別添加2、4、20 μg/kg 3個濃度，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，3種加標(biāo)水平下的回收率為82.3%～108%，RSD為3.5%～8.6%(見表2)。方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足日常檢測定量分析的要求。

表2 17種喹諾酮類化合物的相關(guān)系數(shù)(r2)、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Correlation coefficients(r2),spiked recoveries and RSDs of 17 quinolones(n=6)

圖2 陽性樣品中氧氟沙星的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted chromatogram of ofloxacin in a positive sample

2.4 實際樣品的測定

為評價該方法的有效性，本實驗測定了隨機(jī)抽取的市售水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品各10份，在1份標(biāo)稱具有除痘功效的膏霜樣品中檢出氧氟沙星，檢出量為1.7 mg/kg；其他29份樣品均未檢出目標(biāo)化合物。陽性樣品的提取離子色譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本文利用0.1%甲酸乙腈進(jìn)行超聲提取，正己烷液液萃取脫脂凈化，建立了化妝品中17種喹諾酮類化合物的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測方法。通過對色譜柱、流動相等分離條件和樣品提取凈化條件的優(yōu)化，得到了良好的加標(biāo)回收率和精密度，方法檢出限和定量下限分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。該方法前處理簡單、適用性好，可為化妝品質(zhì)量監(jiān)管和控制提供技術(shù)支持。