張婧雯，張海超*，范 斌，艾連峰，王 敬，李 瑋，康維鈞

(1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017)

安乃近是一種吡唑酮類非甾體抗炎藥，有著較長的應(yīng)用歷史。安乃近在體內(nèi)可幾乎全部迅速水解成活性產(chǎn)物4-甲氨基安替比林(MAA)，其藥理作用主要由MAA產(chǎn)生。MAA在體內(nèi)代謝為4-甲酰氨基安替比林(FAA)和4-氨基安替比林(AA)，AA可以繼續(xù)代謝為4-乙酰氨基安替比林(AAA)。安乃近解熱鎮(zhèn)痛效果顯著，對多種炎癥具有很好的療效，常用于治療急性關(guān)節(jié)炎、頭痛、風(fēng)濕性痛、牙痛及肌肉痛等，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類多種炎癥的治療。但是安乃近的毒副作用極大，會導(dǎo)致腎毒性、皮疹、粒細(xì)胞減少等多種不良反應(yīng)，甚至還可能導(dǎo)致自身免疫性溶血、血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血等[1]。為此，瑞典、美國在70年代就已禁止該藥物用于食源性動(dòng)物中，2013年印度也禁止使用此類藥物，如今安乃近已被30多個(gè)國家禁用[2]。然而，安乃近由于價(jià)格低廉，在法國、德國和中國仍被廣泛用于獸醫(yī)領(lǐng)域，因此對消費(fèi)者的健康造成了一定威脅。以MAA含量計(jì)算，歐盟對安乃近在牛奶中的限量為50 μg/kg，在食源性動(dòng)物組織中的限量為100 μg/kg[3]。在我國,安乃近在食源性動(dòng)物組織中的限量為200 μg/kg[4]。

因此，研究和建立一種快速、高效的動(dòng)物源食品中安乃近代謝物的檢測方法，對于保障畜牧業(yè)健康發(fā)展、促進(jìn)我國農(nóng)牧產(chǎn)品出口、維護(hù)人民身體健康具有重要意義。目前關(guān)于安乃近代謝物的檢測方法主要有液相色譜法[5-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。液相色譜法因定性能力差、靈敏度低，不適用于復(fù)雜基質(zhì)中低含量目標(biāo)物的分析。液相色譜-質(zhì)譜法因其高靈敏度和高專屬性，對動(dòng)物源食品中安乃近代謝物殘留的分析具有明顯優(yōu)勢。由于動(dòng)物源食品基質(zhì)復(fù)雜，含有較多的蛋白、脂肪和磷脂，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，減少對色譜柱和儀器的污染，多采用固相萃取進(jìn)行凈化。但這些固相萃取方式需經(jīng)過活化、上樣、淋洗和洗脫，且整個(gè)前處理過程要經(jīng)過氮吹、濃縮等多個(gè)步驟，大大影響了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和工作效率。

PRiME HLB固相萃取柱因?qū)?dòng)物組織中蛋白、脂肪和磷脂具有特異性吸附能力，凈化效果顯著，近年來被廣泛用于食品基質(zhì)的凈化[12-17]。本研究以豬肉、羊肉、牛肉和牛奶為研究對象，利用PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀直接測定了動(dòng)物源性食品中安乃近代謝物殘留量。該方法無需活化和洗脫等步驟，可直接將提取液上樣，操作簡便、快速，為動(dòng)物源食品中安乃近代謝物殘留的測定提供了新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC 8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)；Sigma 3K-15型離心機(jī)(美國Sigma公司)；PT2100型均質(zhì)器(瑞士Kinematica公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)；渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；Milli-Q純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；PRiME HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，德國Fluka公司)；氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

4-甲氨基安替比林(MAA,CAS號：519-98-2)、4-氨基安替比林(AA，CAS號：83-07-8)、4-甲酰氨基安替比林(FAA,CAS號：1672-58-8)和4-乙酰氨基安替比林(AAA，CAS號：83-15-8)標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制分別精密稱取MAA、AA、FAA和AAA各10 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制分別準(zhǔn)確移取1 mL上述儲備液置于100 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、2、5、10、20、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中。加入20 mL乙腈，于均質(zhì)器上均質(zhì)1 min，加入4 g無水硫酸鈉，搖勻。以8 000 r/min離心5 min，取約2 mL上清液于PRiME HLB固相萃取柱，前1 mL流出液棄去，接收后1 mL流出液于玻璃試管中，過0.22 μm有機(jī)濾膜后供UPLC-MS/MS測試。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：含0.1%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；梯度洗脫程序：0～1.0 min，10%～50% B；1.0～4.0 min，50%～90% B；4.0～6.0 min，90% B；6.0～6.1 min，90%～10% B；6.1～8.0 min，10% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源ESI(+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。離子源溫度為400 ℃，毛細(xì)管溫度為250 ℃，加熱模塊溫度為350 ℃，氮?dú)饬魉?.0 L/min，干燥氣流速10.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min，其他參數(shù)見表1。

表1 4種安乃近代謝物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters of 4 dipyrone metabolites

*quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的選擇

4種安乃近代謝物是一類吡唑酮類的堿性化合物，在中性和堿性條件下穩(wěn)定。目前對安乃近代謝物常用的提取溶劑有乙腈[5,7,9]、5%氨水乙腈[8,10]和0.1 mol/L Na2SO4+0.02 mol/L Na2SO3溶液(pH 7.0)[6,11]。實(shí)驗(yàn)對比了這3種溶劑以及甲醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)采用Na2SO4+Na2SO3提取溶液直接進(jìn)樣時(shí)離子化效果不好，需進(jìn)行溶液的轉(zhuǎn)換才可進(jìn)行儀器分析，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。采用甲醇提取的提取液顏色較渾濁，給凈化過程帶來一定困難。而采用乙腈和5%氨水乙腈提取時(shí)，兩者均可與樣品中的蛋白形成致密沉淀，使得上清液更為澄清且提取效率更高。由于乙腈和5%氨水乙腈在提取效率上無明顯差異，綜合考慮整個(gè)前處理過程的簡便性，最終選乙腈作為提取溶液。

2.2 凈化方式的選擇及凈化效果的評價(jià)

動(dòng)物源性食品中含有較多的蛋白和脂肪等親脂類雜質(zhì)，為減少這些雜質(zhì)對測定目標(biāo)物的干擾和降低對色譜柱及儀器的損耗，需采取有效的凈化方式對提取溶液進(jìn)行凈化。已有文獻(xiàn)通常采用固相萃取、氮吹濃縮等凈化步驟，但這些步驟在實(shí)際操作中極易造成MAA和AA損失和回收率偏低[5-8,10-11]。本文采用PRiME HLB固相萃取柱凈化，在凈化過程中先用1 mL提取液潤洗小柱，然后直接將樣品溶液加載至固相萃取柱以吸附蛋白、脂肪和磷脂等雜質(zhì)，不僅有效凈化了樣品，而且不損失目標(biāo)組分，顯著提高了工作效率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過采取凈化前后對基質(zhì)效應(yīng)的影響來評價(jià)凈化效果，即采用凈化前后牛肉、羊肉、豬肉和牛奶空白基質(zhì)樣品配制的5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液與乙腈配制的5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值進(jìn)行比較，利用以下公式評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的影響[17]：基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(B/A)，其中：B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量4種化合物的響應(yīng)值；A為相同含量標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；ME>1，說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<1，說明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)。由表2可看出，經(jīng)PRiME HLB凈化后，基質(zhì)效應(yīng)的影響明顯減弱，凈化前ME為0.29～1.24，凈化后ME為0.92～1.13。表明采用PRiME HLB的凈化效果顯著，可忽略基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響。

表2 經(jīng)PRiME HLB凈化前后4種安乃近代謝物基質(zhì)效應(yīng)的比較Table 2 Comparison of matrix effects for four dipyrone metabolites before and after purification with a PRiME HLB

圖1 4種安乃近代謝物的標(biāo)準(zhǔn)MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of four dipyrone metabolites mixture standard

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為1 μL。確定各化合物的最佳質(zhì)譜條件，包括離子源溫度、毛細(xì)管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮?dú)饬魉?、選擇特征離子對、Q1和Q3電壓、碰撞能量等質(zhì)譜分析條件。各化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和UPLC的流動(dòng)相溶液混合進(jìn)入ESI電離源，在正負(fù)離子同時(shí)掃描方式下進(jìn)行一級全掃描質(zhì)譜分析，其分子離子峰[M+H]+的響應(yīng)值最高。在正離子模式下對[M+H]+峰進(jìn)行子離子掃描，得到主要子離子，并選擇響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，最終確定多反應(yīng)監(jiān)測的離子對及碰撞能量，建立的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

安乃近代謝物的極性較強(qiáng)，采用乙腈直接進(jìn)樣易造成溶劑效應(yīng)，引起化合物在色譜柱上提前流出。本實(shí)驗(yàn)通過減少進(jìn)樣量的方式降低溶劑效應(yīng)，以AA為例，考察了進(jìn)樣量分別為0.5、1 、2、5 μL時(shí)該化合物的色譜圖，發(fā)現(xiàn)隨著進(jìn)樣量的增加，化合物在色譜上的保留越來越差，當(dāng)進(jìn)樣量增至2 μL時(shí)，甚至有部分化合物隨流動(dòng)相流出。綜合考慮，最終采用進(jìn)樣量為1 μL，以保證化合物的靈敏度和峰形。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)分別選取0.1%甲酸溶液、5 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 4.5)作為水相(A)，甲醇和乙腈分別作為有機(jī)相(B)，對流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸溶液為水相，乙腈為有機(jī)相，采用時(shí)間梯度洗脫條件時(shí)，4種化合物的峰形較好(見圖1)。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

取適量4種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在“1.4”條件下依次測定，以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)進(jìn)行線性分析。在空白樣品中添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”步驟進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣測定，以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，4種化合物均在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.996，LOD和LOQ分別為2、5 μg/kg,其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限如表3所示。方法的靈敏度適用于安乃近代謝物的定量分析。

表3 4種安乃近代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 3 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r),limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of four dipyrone metabolites

2.6 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取了豬肉、牛肉、羊肉和牛奶空白基質(zhì)樣品，分別添加相當(dāng)于5、10和50 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平測定6次，其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4。由表可知，方法的回收率為75.1%～115%，RSD為1.6%～7.4%。

表4 方法的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Spiked recovery and RSD of the method(n=6)

2.7 本方法與傳統(tǒng)方法的比較

動(dòng)物源食品中安乃近代謝物的傳統(tǒng)凈化方式多采用固相萃取。將本方法與傳統(tǒng)檢測安乃近代謝物的分析方法在測定基質(zhì)類型、預(yù)處理過程中有機(jī)試劑用量、實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間三方面進(jìn)行了對比。由表5可知，本方法的前處理消耗試劑量較少、耗時(shí)短、成本低、適用基質(zhì)范圍廣，且該種凈化方式步驟簡單，減少了人為操作誤差。同時(shí)該方法還顯著消除了基質(zhì)對測定結(jié)果的影響，大大提高了方法的簡便性。

表5 本方法與文獻(xiàn)方法的對比Table 5 Comparison of the present method with the previously reported methods

2.8 實(shí)際樣品的分析

采用本方法對送檢的15份新鮮屠宰的豬肉樣品進(jìn)行測定，均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用 PRiME HLB凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了動(dòng)物源食品中4種安乃近代謝物殘留的檢測方法。此方法的前處理凈化效果顯著，消除了基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響。與傳統(tǒng)凈化方式相比，該凈化技術(shù)簡化了前處理過程，操作簡單、快速，提高了工作效率。該方法的建立為動(dòng)物源食品中安乃近代謝物的殘留檢測提供了新的技術(shù)手段。