本土戴爾有孢圓酵母在葡萄酒釀造中的應用潛力

楊詩妮，葉冬青*，賈紅帥，張文靜，宋育陽，劉延琳*

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒發(fā)酵是一個復雜的過程，其中酵母菌起主要作用。在工業(yè)生產(chǎn)中，大多數(shù)的釀酒師傾向于添加商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成發(fā)酵過程，以降低發(fā)酵風險。然而，傳統(tǒng)的自然發(fā)酵并不是由單一S. cerevisiae完成的，非釀酒酵母群體在自然發(fā)酵前期占據(jù)的比例遠超過S. cerevisiae。早期研究認為非釀酒酵母是葡萄酒中的敗壞菌種。近年來，隨著研究者對非釀酒酵母的深入研究，非釀酒酵母的潛在應用價值受到越來越多的關(guān)注，其中采用非釀酒酵母和S. cerevisiae混合發(fā)酵策略更是提升葡萄酒質(zhì)量、突出葡萄酒典型性風格的重要手段。

戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），也是軟假絲酵母（Candida colliculosa）的無性型，廣泛分布于葡萄園、葡萄表皮和釀酒環(huán)境中，是葡萄表面天然微生物群的典型代表。早在1954年，相關(guān)研究指明該菌具有高的乙醇發(fā)酵力，可作為發(fā)酵的啟動菌。隨后，CHR Hansen、Lallemand和Laffort公司紛紛推出了商業(yè)T. delbrueckii[1]。相對于S. cerevisiae，T. delbrueckii具有低產(chǎn)乙醇的特性，其產(chǎn)乙醇能力為8%～14%[2]，相關(guān)研究表明其在低醇葡萄酒生產(chǎn)過程中具有積極作用[3]。T. delbrueckii在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生較少的乙酸、乙酸乙酯、乙醛等，并可以緩慢地發(fā)酵大量的糖，產(chǎn)生較多甘油[4-5]。另外，T. delbrueckii具有良好的環(huán)境耐受力，尤其是高糖耐受力。劉燦珍等[6]對T. delbrueckii耐受性進行分析，結(jié)果顯示T. delbrueckii能夠耐受18%乙醇、400 mg/L SO2和500 g/L糖；劇檸等[7]從枸杞果酒中分離獲得1 株T. delbrueckiiGB-1在100～400 g/L糖、100～250 mg/L SO2的培養(yǎng)基中，24 h內(nèi)可到達生長旺盛期；Bely等[4]將T. delbruecki運用于貴腐酒（原料含糖量350～450 g/L）釀造，不但能啟動發(fā)酵，還保持著高產(chǎn)甘油和低產(chǎn)揮發(fā)酸的特性。

目前，關(guān)于優(yōu)良T. delbrueckii菌株的篩選及其對葡萄酒品質(zhì)的影響已成為國外研究者的熱點。Renault等[5]發(fā)現(xiàn)接種T. delbrueckii的混合發(fā)酵提高了紅葡萄酒的復雜性和果香風味。Whitener等[8]指出某些特定的戴爾有孢圓菌株可生成高濃度的萜烯化合物，包括α-萜品醇、芳樟醇、香葉醇等，從而提高瓊瑤漿、雷司令等品種香氣。Ramírez等[9]篩選出具有嗜殺性的T. delbrueckii，并與S. cerevisiae混合發(fā)酵，結(jié)果顯示T. delbrueckii顯著提高了赤霞珠成品酒的口感以及香氣復雜度和濃郁度。

我國疆域遼闊，葡萄酒產(chǎn)區(qū)氣候變化多樣，優(yōu)越的自然條件孕育著豐富的酵母資源，來自不同地區(qū)的酵母對葡萄酒質(zhì)量的影響具有獨特的地理特征[10]，因此充分利用本土酵母資源，可以提高葡萄酒的“風土”特征。然而，我國關(guān)于本土酵母對葡萄酒品質(zhì)影響的相關(guān)研究較少，具有葡萄酒釀造特色的本土酵母資源的分離、保藏和菌種庫的建立仍然十分欠缺，對本土非釀酒酵母的開發(fā)利用更是寥寥無幾。T. delbrueckii作為優(yōu)良非釀酒酵母之一，具有多種應用潛力。目前我國對T. delbrueckii的關(guān)注度不高，少有的關(guān)于T. delbrueckii的研究也是泛泛介紹了非釀酒酵母的發(fā)酵特性[7,11]，或是以商業(yè)T. delbrueckii為原材料[12]，僅針對其對香氣的影響[13]，至今鮮見關(guān)本土T. delbrueckii在葡萄酒中應用的詳細報道。

本實驗以從甘肅祁連酒廠冰酒釀造過程中分離得到的3 株T. delbrueckii為材料，對其耐受性和發(fā)酵性能進行研究；按照小容器釀造工藝法，選取性能優(yōu)良的菌株T. delbrueckiiR12與S. cerevisiaeNX11424混合發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，探究不同接種方式和接種比例對發(fā)酵過程的影響，為T. delbrueckii在葡萄酒生產(chǎn)實踐中的應用提供參考，為優(yōu)質(zhì)葡萄酒的風格塑造和本土葡萄酒的風土多樣性表達提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T. delbrueckiiR12、R85、R150分離自甘肅祁連酒廠；S. cerevisiaeNX11424保藏于西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院。

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast extract protein dextrose，YEPD）、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培養(yǎng)基、YEPD-亞甲基藍（methylene blue，MB）培養(yǎng)基分別參照文獻[14-16]。Triple M模擬汁[17]：1.25% Tween80，3.75% 95%乙醇溶液，0.012 5%麥角固醇，10%葡萄糖，10%果糖，0.6%L-(+)-酒石酸，0.3%L-(-)-蘋果酸，0.05%檸檬酸，0.17% YNB，0.2%酸水解酪蛋白，0.000 6%肌醇，0.02%無水氯化鈣，0.08%L-精氨酸，0.1%L-脯氨酸，0.01%DL-色氨酸，0.1%磷酸銨，氫氧化鉀調(diào)pH 6.4。300 g/L和400 g/L高糖模擬汁參照Triple M模擬汁調(diào)整總糖質(zhì)量濃度，葡萄糖和果糖均按照1∶1添加，其余物質(zhì)質(zhì)量濃度不變。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外分光光度計 日本島津公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BK1301生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將甘油管保藏菌劃線于YEPD固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d。在YEPD固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液。

1.3.2 生長曲線的測定

將活化菌株按2%的接種量接種于40 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每株菌設(shè)3 組重復。每隔2 h取樣測定OD600nm，以未接種的YEPD培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.3 耐受性實驗

在試管中添加不同耐受基質(zhì)（YEPD培養(yǎng)基）并加入杜氏管，按2%接種量接入活化菌株，28 ℃培養(yǎng)，設(shè)3 組重復，通過監(jiān)控產(chǎn)氣情況以確定接種菌株的生長到達穩(wěn)定期后測定OD600nm。

1.3.3.1 乙醇耐受性

滅菌之后的YEPD培養(yǎng)基調(diào)整初始乙醇體積分數(shù)為8%、10%、12%、14%進行實驗。

1.3.3.2 SO2耐受性

滅菌之后的YEPD培養(yǎng)基調(diào)整SO2質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500、600 mg/L進行實驗。

1.3.3.3 高糖耐受性

調(diào)整YEPD培養(yǎng)基初始葡萄糖質(zhì)量濃度為200、300、400 g/L進行實驗。

1.3.4 酵母絮凝性測定

參照文獻[18]方法進行測定。

1.3.5 酵母嗜殺性檢驗[16]

將5 μL T. delbrueckii菌液點樣于均勻涂有S. cerevisiae NX11424的YEPD-MB培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)2～3 d。若待測菌為嗜殺菌，其周圍會形成藍色的死菌帶和透明抑菌圈。

1.3.6 模擬發(fā)酵實驗

配制不同糖質(zhì)量濃度的模擬汁，先將酵母種子液以2%的接種量接種于50 mL模擬汁中，于25 ℃、90 r/min預培養(yǎng)24 h。隨后將預培養(yǎng)的酵母細胞，以5×105CFU/mL接種量接種于裝有300 mL模擬汁的發(fā)酵瓶中，20 ℃靜置發(fā)酵。發(fā)酵過程中每24 h監(jiān)測CO2質(zhì)量損失，連續(xù)3 d CO2質(zhì)量損失不變示為發(fā)酵結(jié)束。每組重復3 次。發(fā)酵結(jié)束后，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定乙醇、殘?zhí)?、總酸和揮發(fā)酸。

1.3.7 小容器發(fā)酵釀造干紅葡萄酒

赤霞珠葡萄于2016年采自陜西張裕瑞那城堡酒莊，其總糖質(zhì)量濃度為270.1 g/L，可滴定酸質(zhì)量濃度為5.0 g/L（以酒石酸計），pH 3.14。

按干紅葡萄酒的小容器釀造法（2 L），葡萄破碎后添加60 mg/L SO2和600 mg/L二甲基二碳酸鹽殺菌處理，靜置24 h。將T. delbrueckii R12與S. cerevisiae NX11424按1∶1、10∶1和20∶1的比例同時接種或順序接種（間隔2 d接入S. cerevisiae）進行混合發(fā)酵，其中R12接種量為1×106CFU/mL（血球板計數(shù)法），NX11424的接種量按比例計算；以R12和NX11424單獨發(fā)酵為對照，接種量均為1×106CFU/mL。發(fā)酵溫度25 ℃，每個處理3 組重復。采用WLN平板計數(shù)法[15,20]，依據(jù)酵母生長狀況及發(fā)酵進程對發(fā)酵過程中4 個階段（發(fā)酵啟動時、糖消耗1/2時、糖消耗3/4時、發(fā)酵結(jié)束）的菌落數(shù)進行監(jiān)控，其中S. cerevisiae NX11424菌落呈乳白色錐狀凸起，T. delbrueckii R12菌落呈奶油色球狀凸起，頂端呈綠色。通過測定還原糖監(jiān)控發(fā)酵進程，發(fā)酵結(jié)束后參照GB/T 15038—2006測定葡萄酒基本理化指標。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法；Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 T. delbrueckii菌株的生長曲線

圖1 T. delbrueckii菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of T. delbrueckii strains

如圖1所示，3 株T. delbrueckii在經(jīng)過約2 h的延滯期后，于接種后8 h進入生長對數(shù)期，16 h后菌體數(shù)量基本保持穩(wěn)定。其中R150在YEPD培養(yǎng)基中的生長能力優(yōu)于其他兩株，生長最快，穩(wěn)定期菌體數(shù)最大。

2.2 T. delbrueckii菌株的耐受性

在自然發(fā)酵的早期，非釀酒酵母是葡萄汁中的優(yōu)勢菌，然而隨著發(fā)酵的進行，其優(yōu)勢地位逐漸被S. cerevisiae所取代，多數(shù)非釀酒酵母在乙醇發(fā)酵旺盛期時消失。非釀酒酵母的生長主要受到發(fā)酵溫度、乙醇體積分數(shù)、SO2添加量、低pH值、葡萄汁滲透壓及營養(yǎng)等條件的影響[21]。因此，非釀酒酵母對糖、SO2、乙醇的耐受性將決定它們在葡萄酒發(fā)酵中所起的作用。

2.2.1 乙醇耐受性

在葡萄酒的生產(chǎn)過程中，酵母菌的主要作用是將糖代謝生成乙醇，但是當培養(yǎng)基中的乙醇累積到一定體積分數(shù)時，會對酵母細胞產(chǎn)生有毒效應。酵母的乙醇耐受性很大程度上影響了其在整個發(fā)酵過程中的存活時間和發(fā)酵活性。本研究考察T. delbrueckii在8%～14%乙醇體積分數(shù)范圍內(nèi)的生長狀況。如圖2所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，OD600nm持續(xù)下降，酵母生長受到的影響越大。當乙醇體積分數(shù)在10%以內(nèi)時，3 株菌均能保持一定的生長量，其中R150的生長量顯著高于另外兩株（P＜0.05）。當乙醇體積分數(shù)升高到12%時，3 株T. delbrueckii的生長才受到明顯抑制，說明本土T. delbrueckii具有較強的乙醇耐受性。相關(guān)研究也表明，與葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母等多數(shù)非釀酒酵母相比，T. delbrueckii具有更強的乙醇耐受力[22]，這也就確保了其在發(fā)酵過程中持續(xù)保持良好的發(fā)酵活性和正常的代謝活動。

圖2 T. delbrueckii菌株的乙醇耐受性Fig. 2 Ethanol tolerance of T. delbrueckii strains

2.2.2 SO2耐受性

葡萄酒的釀造過程中，一般需要在葡萄汁中添加60 mg/L的SO2以達到抗氧化和殺菌的目的，足夠的SO2耐受力能確保酵母在發(fā)酵初期快速生長繁殖。如圖3所示，3 株T. delbrueckii對SO2具有較強的耐受性。當SO2質(zhì)量濃度小于200 mg/L時，3 株T. delbrueckii均能很好地生長，生長狀況受SO2含量影響不大。當SO2質(zhì)量濃度在200～400 mg/L之間，3 株T. delbrueckii的生長隨著SO2質(zhì)量濃度的增大而減弱，但仍能保持一定的生物量水平（OD600nm＞2.5），其中R150的生長量高于其他兩株。當SO2質(zhì)量濃度大于500 mg/L，三者的生長均受到明顯抑制。

圖3 T. delbrueckii的SO2耐受性Fig. 3 SO2 tolerance of T. delbrueckii strains

2.2.3 高糖耐受性

葡萄汁高糖質(zhì)量濃度不僅抑制酵母生長，同時影響細胞代謝[23]。如圖4所示，R150隨著糖質(zhì)量濃度的增加，OD600nm呈上升趨勢，400 g/L糖質(zhì)量濃度下依然保持著良好的生長狀況。R12和R85對糖的耐受力無顯著差異，糖質(zhì)量濃度為400 g/L時R85具有更大的生長量，而R12在300 g/L和400 g/L糖質(zhì)量濃度下均可保持良好的生長（OD600nm＞2.5）。事實上，在高質(zhì)量濃度糖發(fā)酵的初期，細胞所受到的糖抑制作用大于乙醇的作用，當糖度達到25°Brix時，乙醇發(fā)酵出現(xiàn)延滯；高于30°Brix時，單位糖的乙醇產(chǎn)率顯著降低[24]。此外，高質(zhì)量濃度糖造成的高滲透壓促使酵母菌產(chǎn)生更多的乙酸，使得冰酒、貴腐等甜型葡萄酒面臨揮發(fā)酸含量超標的風險[4,25]。從以上結(jié)果可見，本實驗從冰葡萄汁中篩選獲得的3 株T. delbrueckii對于高糖均具有很好的耐受性，這對于高糖葡萄汁發(fā)酵的順利進行以及揮發(fā)酸含量的控制具有重要意義。

圖4 T. delbrueckii菌株的高糖耐受性Fig. 4 High sugar tolerance of T. delbrueckii strains

2.3 T. delbrueckii菌株的絮凝性

在葡萄酒的釀造過程中，酵母良好的絮凝性可使葡萄酒發(fā)酵液澄清速度加快，降低酵母分離的能量消耗，同時防止酵母細胞因長時間懸浮在發(fā)酵液中導致細胞自溶而影響葡萄酒風味[26]，也避免因絮凝性過強而造成發(fā)酵度低[27]。在酵母菌絮凝性評價中，絮凝值為70%～100%，屬于低絮凝性；絮凝值為30%～70%，屬于中絮凝性；絮凝值為0%～30%，屬于高絮凝性[18]。由圖5可知，3 株T. delbrueckii的絮凝值為48%～68%，均滿足葡萄酒釀造的需求。

圖5 T. delbrueckii菌株的絮凝性Fig. 5 Flocculation levels of T. delbrueckii strains

2.4 T. delbrueckii菌株的嗜殺性

嗜殺酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中能夠分泌毒素，抑制或殺死敏感細胞[16]。由圖6可知，3 株T. delbrueckii周圍均無藍色死菌帯和透明圈，說明3 株T. delbrueckii均對S. cerevisiaeNX11424無嗜殺作用。

圖6 T. delbrueckii菌株的嗜殺性Fig. 6 Killer activity of T. delbrueckii strains

2.5 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii的發(fā)酵性能

2.5.1 發(fā)酵速率

圖7 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii的發(fā)酵曲線Fig. 7 Fermentation curves of T. delbrueckii strains at different sugar concentrations

在葡萄酒釀造過程中，期望適宜的發(fā)酵速率，因為過快的發(fā)酵速度會導致溫度上升，生香過程縮短，葡萄酒品質(zhì)下降[28]。本實驗通過檢測CO2質(zhì)量損失監(jiān)控模擬汁的發(fā)酵進程。由圖7可知，在3 種糖質(zhì)量濃度下，3 株T. delbruecki單獨接種發(fā)酵時間均較長，發(fā)酵效率低，且隨著糖質(zhì)量濃度的升高，發(fā)酵力不斷降低。這符合一般非釀酒酵母相對低發(fā)酵力的特性。在糖質(zhì)量濃度為200 g/L的發(fā)酵液中，3 株菌株的發(fā)酵能力沒有顯著差異。在糖質(zhì)量濃度為300 g/L和400 g/L的發(fā)酵液中，3 株菌的發(fā)酵能力差異顯著，表現(xiàn)為R85＞R12＞R150。當糖質(zhì)量濃度達到400 g/L時，3 株菌株的發(fā)酵均受到明顯抑制，總CO2質(zhì)量損失較另外2 個質(zhì)量濃度的處理降低將近一半。

2.5.2 理化指標

表1 不同糖質(zhì)量濃度下T. delbrueckii菌株發(fā)酵酒樣的理化指標Table 1 Physicochemical properties of wines fermented with three T. delbrueckii strains at different initial sugar concentrations

如表1所示，當模擬汁糖質(zhì)量濃度為200 g/L時，三者均能完成發(fā)酵，殘?zhí)橇康陀? g/L，乙醇體積分數(shù)在11%左右。相較于其他兩株菌，R12的揮發(fā)酸產(chǎn)量更低。當糖質(zhì)量濃度為300 g/L時，3 株T. delbrueckii的發(fā)酵力受到不同程度的影響，殘?zhí)橇烤笥?0 g/L，其中R12和R85發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇糠謩e為46.10 g/L和36.60 g/L，乙醇體積分數(shù)均在15%左右，R150發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇縿t高達69.05 g/L。當糖質(zhì)量濃度為400 g/L時，3 株T. delbrueckii的發(fā)酵能力急劇下降，即使是發(fā)酵能力最強的R85發(fā)酵液中殘?zhí)侨赃_264.99 g/L，乙醇體積分數(shù)6.75%，發(fā)酵能力較弱的R12和R150殘?zhí)橇糠謩e為295.11 g/L和315.65 g/L，乙醇體積分數(shù)分別為5.80%和4.52%?？傮w來看，R85對糖的利用率更高，尤其是在高糖條件下。雖然T. delbrueckii在400 g/L YEPD高糖培養(yǎng)基中生長良好，但在同樣糖質(zhì)量濃度的葡萄模擬汁中并不能很好地完成發(fā)酵，這與菌株處于不同的生長條件有關(guān)，在模擬汁的發(fā)酵過程中，酵母除受高糖滲透壓脅迫，還同時受到乙醇、低pH值等多因素的影響[23]。相關(guān)研究認為T. delbrueckii作為非釀酒酵母中具有較強發(fā)酵力的菌株，能將大量的糖轉(zhuǎn)化為乙醇，可獨立完成乙醇度較低的某些特殊啤酒和起泡酒的釀造[29-30]，這與本實驗的研究結(jié)論一致。

2.6 T. delbrueckii和S. cerevisiae混合發(fā)酵

從上述研究結(jié)果可見，T. delbrueckii單獨接種進行乙醇發(fā)酵往往耗時長，且在含糖量較高的情況下難以完成發(fā)酵。因此采用混合發(fā)酵，對不同菌種“取長補短”是當前研究的一個熱點，也是提高葡萄酒品質(zhì)的有效方法之一。本研究綜合考慮耐受性、適宜的發(fā)酵力以及對模擬汁發(fā)酵后的感官香氣評價，選取香氣濃郁度更強的T. delbrueckiiR12與S. cerevisiaeNX11424進行赤霞珠葡萄酒的混合發(fā)酵。發(fā)酵曲線如圖8所示，NX11424純種發(fā)酵的發(fā)酵速率最快，于第7天完成發(fā)酵。R12純種發(fā)酵耗時最長，于第14天結(jié)束發(fā)酵。同時接種的3 組處理均于第9天左右完成發(fā)酵，其中處理T1發(fā)酵速率最快。順序接種的3 組處理的發(fā)酵曲線基本一致，共耗時11 d左右完成發(fā)酵。

圖8 不同接種方式和接種比例下的混合發(fā)酵曲線Fig. 8 Time-course curves of mixed-culture fermentation with different inoculums and inoculation methods

分別在發(fā)酵過程中的4 個時期取樣，采用WLN涂板計數(shù)的方法對菌株定植能力進行考察，結(jié)果如圖9所示。不同處理下，T. delbrueckii和S. cerevisiae的數(shù)量在發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。相比于同時接種，順序接種處理中R12的最大增值量顯著提高（最大值S20約為4.0×107CFU/mL），且一直保持到發(fā)酵結(jié)束，而對應的NX11424的最大增殖量則顯著降低，但發(fā)酵結(jié)束時不同處理的數(shù)量差別不大。在不同比例的處理中，NX11424接種量的增加均導致R12增殖數(shù)量的降低。在同時接種處理中，兩種酵母相互競爭，生長能力及耐受性更強的S. cerevisiae迅速占據(jù)主導地位，處于弱勢地位的T. delbrueckii種群數(shù)量下降較快。從圖9A、B可知，同時接種處理中，R12在st2時數(shù)量開始下降，而順序接種處理的R12可增殖至st3。在順序接種處理中，由于T. delbrueckii的生長空間更大，S. cerevisiae接入時T. delbrueckii數(shù)量已經(jīng)到達一定的水平，再加上此時營養(yǎng)物質(zhì)已被消耗，S. cerevisiae的增殖空間有限，較難成為優(yōu)勢菌群，在st3時，NX11424的數(shù)量低于R12。本實驗結(jié)果表明，本土T. delbrueckii在葡萄酒釀造過程中具有良好的定植能力，在發(fā)酵初期可快速增殖，整個發(fā)酵過程中均能保持一定的生物量水平，可以影響葡萄酒的質(zhì)量風格。相關(guān)研究也表明，T. delbrueckii在發(fā)酵過程中的強定植能力還能在一定程度上抑制其他有害微生物的生長，有助于提升葡萄酒的質(zhì)量[31]。

圖9 不同接種處理發(fā)酵中T. delbrueckii與S. cerevisiae菌株在不同階段的數(shù)量變化Fig. 9 Populations of T. delbrueckii and S. cerevisiae at different stages of fermentation

表2 發(fā)酵結(jié)束后基本理化指標Table 2 Physicochemical properties of wines fermented with pure and mixed starter cultures

如表2所示，除R12單獨發(fā)酵，其余7 組處理發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇烤∮? g/L。8 組處理的乙醇體積分數(shù)在12.0%～13.5%之間，其中NX11424單獨發(fā)酵和處理T1乙醇體積分數(shù)最高，R12單獨發(fā)酵乙醇體積分數(shù)最低。8 組處理的揮發(fā)酸均小于0.6 g/L，其中T. delbrueckii純種發(fā)酵和混合發(fā)酵揮發(fā)酸產(chǎn)量均顯著低于S. cerevisiae純種發(fā)酵，且隨著T. delbrueckii所占比例的增加，揮發(fā)酸降低幅度增大。這也與Chen Kai等[32]報道的T. delbrueckii是低揮發(fā)酸生產(chǎn)者的研究一致。

3 結(jié) 論

目前大多數(shù)葡萄酒釀造多選用商業(yè)S. cerevisiae接種發(fā)酵，其優(yōu)點是發(fā)酵周期短、成品酒質(zhì)量穩(wěn)定。但這種同一化使酒體單一，缺乏個性。加強本土酵母資源和非釀酒酵母的開發(fā)利用有助于釀造具有地方特色、風格獨特的葡萄酒。本實驗以甘肅祁連產(chǎn)區(qū)篩選出的3 株T. delbrueckii為研究對象，通過對其生長特性、絮凝性以及乙醇、SO2、高糖耐受性的分析發(fā)現(xiàn)，3 株T. delbrueckii均具有良好的生長能力以及較好的高乙醇、高糖質(zhì)量濃度等逆境耐受性和中等絮凝性。為進一步探究本土T. delbrueckii在實際葡萄酒釀造中的應用潛能，本研究選擇T. delbrueckii R12與S. cerevisiae NX11424按照不同接種方式和接種比例混合發(fā)酵釀造赤霞珠干紅葡萄酒?；旌习l(fā)酵6 組處理均能完成乙醇發(fā)酵，且R12在發(fā)酵過程中，均保持了良好的定植能力，其中順序接種處理中R12的增殖量更大。另外，T. delbrueckii的接種比例對揮發(fā)酸含量有顯著影響，R12接種比例越大，發(fā)酵酒樣中揮發(fā)酸的含量則越低，這對甜型葡萄酒的釀造具有重要意義。

充分利用本土酵母資源，合理運用混菌發(fā)酵策略，既降低了發(fā)酵過程中的不可預測性，又保留了非釀酒酵母的代謝足跡，是有效解決成品酒風格單一的方法之一。本研究結(jié)果表明本土T. delbrueckii在葡萄酒的釀造中具有較大的應用價值，在后續(xù)研究中，將進一步研究其與S. cerevisiae互作及對不同類型葡萄酒品質(zhì)指標的全面影響，以期為我國優(yōu)良本土S. cerevisiae的選育工作及釀造風格多樣化的葡萄酒提供指導。