劉海霞，李雪明，宋天順,2，謝婧婧,2,3

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；3.江蘇省先進(jìn)生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210009)

隨著能源危機(jī)的日益加重，開發(fā)綠色能源已經(jīng)成為目前迫切的研究方向之一[1-3]。微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)是一種應(yīng)用前景廣泛的綠色能源系統(tǒng)[4-7]，它利用產(chǎn)電微生物的新陳代謝，降解有機(jī)底物，產(chǎn)生胞外電子和質(zhì)子，電子通過陽極傳遞至陰極，質(zhì)子通過質(zhì)子交換膜由陽極室轉(zhuǎn)移至陰極室，從而實(shí)現(xiàn)將儲(chǔ)存在有機(jī)底物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能[4-7]。MFC是以微生物菌株作為催化劑，通過微生物代謝將存儲(chǔ)于生物質(zhì)中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的一種環(huán)保裝置[8-12]。

在MFC中,電化學(xué)活性微生物由于其細(xì)胞膜上具有電活性的氧化還原酶，可以與電極直接發(fā)生電子傳遞，但大多數(shù)的微生物菌株不能和電極直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)換，為提高非電化學(xué)活性微生物氧化底物傳遞電子的效率，需要借助適量電子介體的幫助[13-17]，以顯著改善電子的轉(zhuǎn)移速率。用于這類MFC的有效電子介體應(yīng)具備以下特性[18-21]：①良好的穩(wěn)定性、溶解性且不能被細(xì)菌代謝。②易穿過細(xì)胞壁，易獲取電子。③電極上氧化還原反應(yīng)速率快，可逆性好。

本文中，筆者以3種電子介體(中性紅、亞甲基藍(lán)和甲基紫精)為對象，研究它們對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制情況及對其MFC產(chǎn)電性能的影響，以期為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

大腸桿菌BL21(DE3)為南京工業(yè)大學(xué)謝婧婧教授課題組長期保存菌株。

蛋白胨、酵母粉、鐵氰化鉀、葡萄糖、NaCl等實(shí)驗(yàn)試劑均為市售分析純。

M9培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖4、NH4Cl 1、NaCl 0.5、Na2HPO44.756、NaH2PO42.452。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10；自然pH。

陰極液組(g/L)：KCl 0.13、Na2HPO411.53、NaH2PO42.772、K3Fe(CN)613.2。

GRP-905型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；數(shù)據(jù)采集器，美國吉時(shí)利電子有限公司；電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；H型 MFC反應(yīng)器，廣西理化有限公司。

1.2 MFC反應(yīng)器構(gòu)建

采用雙室微生物燃料電池反應(yīng)器，結(jié)構(gòu)如圖1所示，陽離子交換膜(Nafion 117,美國杜邦公司)將陰、陽兩室隔開，兩室溶液體積均為250 mL。陰陽極電極材料均為石墨氈，陰、陽電極物理表面積均為25 cm2×2，陰陽極之間通過鈦絲相連，除實(shí)驗(yàn)因素外，外接電阻均為1 000 Ω。MFC 均置于25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中運(yùn)行。陽極液由95% M9培養(yǎng)基和5% LB培養(yǎng)基構(gòu)成。

圖1 微生物燃料電池原理工作圖Fig.1 Mechanism for microbial fuel cell

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制實(shí)驗(yàn)

常見電子介體對菌的生長抑制情況是通過菌液涂布計(jì)數(shù)比較得出，具體步驟為：①菌種的液體活化。準(zhǔn)備滅菌后的液體LB，以10%的接種量活化從冰箱中保存的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在恒溫?fù)u床(200 r/min)中37 ℃培養(yǎng)12 h，待用。②制備含有不同濃度電子介體的LB平板。配制含有不同質(zhì)量濃度的中性紅和亞甲基藍(lán)(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L)的LB平板。由于甲基紫精，也叫百草枯，生物毒性大，因此平板制備濃度要低于中性紅和亞甲基藍(lán)。配制含有不同質(zhì)量濃度(0、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 g/L)甲基紫精的LB平板。③菌液涂布計(jì)數(shù)。將活化后的菌液等量稀釋涂布于LB平板上，涂布結(jié)束后將平板放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后對平板上長出的大腸桿菌BL21(DE3)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定其生長抑制情況。

1.3.2 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能影響

依據(jù)電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制結(jié)果，選擇合適的實(shí)驗(yàn)濃度，開展同一濃度下不同電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能的影響實(shí)驗(yàn)，選擇對MFC產(chǎn)電能力提高顯著的電子介體后再進(jìn)行濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.4 MFC性能參數(shù)測定及計(jì)算

1.4.1 電壓和電流

電壓(U)由山特(深圳)電子有限公司數(shù)據(jù)采集器每間隔10 min 自動(dòng)記錄儲(chǔ)存。電流由I=U/R(R為實(shí)際外接電阻)計(jì)算得到[21-23]。

1.4.2 電池表觀內(nèi)阻及功率密度曲線

采用穩(wěn)態(tài)放電法測定MFC的表觀內(nèi)阻。分別測量MFC在不同外電阻(5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、800、600、400、200、100、50和30 Ω)條件下穩(wěn)定放電時(shí)的外電阻電壓，并通過I=U/R得到電流，輸出功率(P)是根據(jù)P=IU得出[24]。以電流為橫坐標(biāo)，電壓為縱坐標(biāo)，繪制所得曲線為極化曲線。極化曲線是用來表征電壓與電流關(guān)系的曲線，將極化曲線的歐姆極化區(qū)部分?jǐn)?shù)據(jù)線性擬合所得斜率即為電池表觀內(nèi)阻。再以電流為橫坐標(biāo)，各外阻條件下產(chǎn)生的功率密度為縱坐標(biāo)繪制曲線，即得電池功率密度曲線，功率密度曲線是用來表示電流和功率密度關(guān)系的曲線[17,22-24]。

1.4.3 循環(huán)伏安曲線測定

循環(huán)伏安法(CV)使用CHI660D型三電極系統(tǒng)恒電位儀(上海辰華儀器有限公司)進(jìn)行測定。其中，陽極對應(yīng)工作電極，陰極對應(yīng)對電極，Ag/AgCl電極對應(yīng)參比電極。掃描電壓為-1.0～1.0 V，掃描速度為20 mV/s，同時(shí)監(jiān)測電流響應(yīng)值[17,25-27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制情況

人工電子介體雖然能夠幫助大腸桿菌BL21(DE3)將電子傳遞到電極上，但也會(huì)對其生長有一定的抑制作用。因此，在進(jìn)行產(chǎn)電性能影響實(shí)驗(yàn)之前，有必要確定所選擇電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制濃度范圍。

考察大腸桿菌BL21(DE3)在含有不同質(zhì)量濃度的中性紅、亞甲基藍(lán)以及甲基紫精的LB平板上的生長情況，結(jié)果見圖2。

圖2 電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)生長的影響Fig.2 Effects of electron mediator on the growth of E. coli BL21(DE3)

由圖2可知：大腸桿菌BL21(DE3)含有不同濃度的中性紅平板上的菌落數(shù)分別為100、94、85、79、68和65個(gè)。盡管中性紅為無毒染料，但是生長抑制實(shí)驗(yàn)證明，隨著濃度的增加，中性紅對大腸桿菌BL21(DE3)生長的抑制也隨之增加。可能的原因是中性紅延長了菌落生長的時(shí)間，因此在24 h內(nèi)計(jì)數(shù)出現(xiàn)上述結(jié)果，當(dāng)延長計(jì)數(shù)時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)高濃度平板上繼續(xù)會(huì)有新的菌落出現(xiàn)。

大腸桿菌BL21(DE3)在不同濃度的亞甲基藍(lán)的LB平板上的生長的菌落數(shù)分別為100、30、1、1、1和1 個(gè)。當(dāng)亞甲基藍(lán)的質(zhì)量濃度大于0.4 g/L時(shí)，在24 h內(nèi)大腸桿菌BL21(DE3)在平板上幾乎沒有菌落生成，觀察生成的菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其菌落大小明顯小于低濃度平板上的菌落。說明添加高質(zhì)量濃度(>0.4 g/L)亞甲基藍(lán)的對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制顯著。

大腸桿菌BL21(DE3)在含有不同濃度甲基紫精的LB平板上的生長的菌落數(shù)分別為100、55、43、1、1和1個(gè)。在質(zhì)量濃度超過0.03 g/L及以上濃度的甲基紫精LB平板上都只有1個(gè)菌落生長，同亞甲基藍(lán)類似，這說明甲基紫精對于大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制較明顯。

電子介體對于大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制從高到低依次是甲基紫精、亞甲基藍(lán)、中性紅。

2.2 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能影響結(jié)果

2.2.1 大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能比較

考慮到未來實(shí)驗(yàn)放大要求，所以實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)篩選合適的電子介體，還必須滿足添加量少且提高效果顯著的要求，結(jié)合菌株生長抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)最終確定研究質(zhì)量濃度為0.02 g/L的中性紅、亞甲基藍(lán)、甲基紫精對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能的影響，結(jié)果如圖3～5和表1所示。

圖3 不同電子介體實(shí)驗(yàn)組MFC輸出電壓Fig.3 Voltage output of the MFC with different electron mediator

由圖3可知：添加亞甲基藍(lán)對大腸桿菌BL21(DE3)產(chǎn)電性能的提高是最顯著的，MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為389 mV；添加中性紅的實(shí)驗(yàn)組，MFC能夠達(dá)到的最高電壓值為130 mV，并且電壓峰值(130 mV)只維持了6 h左右；添加甲基紫精的實(shí)驗(yàn)組，MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值只有70 mV，而對照組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為80 mV。亞甲基藍(lán)的輸出電壓較對照組的提高了386%，添加甲基紫精的實(shí)驗(yàn)組輸出電壓與對照組相比沒有提高，中性紅組的輸出電壓提高不顯著。

表1 添加常見電子介體各實(shí)驗(yàn)組MFC的最大輸出功率密度及表觀內(nèi)阻

圖4 常見電子介體MFC的功率密度及極化曲線Fig.4 Power density (a) and polarization curve (b) of the MFC

圖5 常見電子介體MFC循環(huán)伏安曲線Fig.5 Different electron mediator circulation volt-ampere curve

由圖4和表1可知：添加亞甲基藍(lán)的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)電能力最優(yōu)，其所測得的最大輸出功率密度高達(dá)160 mV/m2，而對照組僅為18 mV/m2；甲基紫精組和中性紅組的最大輸出功率分別為3.8和5.2 mV/m2。對各實(shí)驗(yàn)組MFC極化曲線歐姆區(qū)進(jìn)行線性擬合后得到各MFC的表觀內(nèi)阻，其中亞甲基藍(lán)組的表觀內(nèi)阻最低，約為159 Ω；中性紅組的表觀內(nèi)阻約為380 Ω；甲基紫精組的表觀內(nèi)阻約為278 Ω，對照組的表觀內(nèi)阻為290 Ω。由此可見，添加亞甲基藍(lán)的表觀內(nèi)阻最小，較對照組降低約52%。

由圖5可知：亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組測得的氧化還原電流響應(yīng)值最高，且明顯較對照組MFC信號強(qiáng)，中性紅次之，甲基紫精與對照組無明顯差異。CV分析證明添加亞甲基藍(lán)的MFC組能夠提高大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產(chǎn)電性能，由此可以確定亞甲基藍(lán)作為電子介體可以增強(qiáng)陽極電極的電化學(xué)活性，這與輸出電壓、功率密度和極化曲線的結(jié)論一致。這可能是由于亞甲基藍(lán)具有從細(xì)菌細(xì)胞膜上高效轉(zhuǎn)移電子的能力。

圖7 添加不同濃度亞甲基藍(lán)的MFC功率密度及極化曲線Fig.7 Power density (a) and polarization curve of MFC (b) with different concentration of methylene blue

2.2.2 亞甲基藍(lán)濃度優(yōu)化

在0.02 g/L中性紅、亞甲基藍(lán)和甲基紫精作用下，添加亞甲基藍(lán)對大腸桿菌BL21(DE3)的產(chǎn)電能力提高最顯著，因此考察不同質(zhì)量濃度的亞甲基藍(lán)對提高大腸桿菌BL21(DE3)MFC產(chǎn)電性能的影響，結(jié)果如圖6～8和表2所示。

圖6 添加不同濃度亞甲基藍(lán)的各實(shí)驗(yàn)組MFC輸出電壓Fig.6 Voltage output of the MFC with different concentration of methylene blue

由圖6可知：添加0.02 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為389 mV;添加0.04 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為380 mV;添加0.06 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為500 mV;添加0.08 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為375 mV;添加0.10 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為300 mV，對照組MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為80 mV，分別較對照提高了386%、375%、525%、371%和275%。

由圖7和表2可知：添加0.02 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC所獲得的最大輸出功率密度為160 mV/m2；添加0.04 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC所獲得的最大輸出功率密度為184 mV/m2；而0.06 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)電能力最優(yōu)，其所獲得的最大輸出功率密度高達(dá)208 mV/m2；添加0.08 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC所獲得的最大輸出功率密度為178 mV/m2；添加0.10 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC所獲得的最大輸出功率密度為156 mV/m2，對照組MFC的最大輸出功率密度為18 mV/m2。

對各實(shí)驗(yàn)組MFC極化曲線歐姆區(qū)進(jìn)行線性擬合得到的各MFC表觀內(nèi)阻結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加0.02 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC表觀內(nèi)阻為159 Ω，添加0.04 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC表觀內(nèi)阻為153 Ω，添加0.06 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組表觀內(nèi)阻為140 Ω，添加0.08 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC表觀內(nèi)阻為157 Ω，添加0.1 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組MFC表觀內(nèi)阻為172 Ω，對照組的表觀內(nèi)阻為290 Ω，分別比對照組降低45.1%、47.2%、51.7%、45.8%和40.6%。

由圖8可知：添加0.06 g/L亞甲基藍(lán)實(shí)驗(yàn)組的氧化還原電流響應(yīng)值最高，之后依次為添加0.04、0.08和0.02 g/L亞甲基藍(lán)的實(shí)驗(yàn)組。CV分析證明加入0.06 g/L亞甲基藍(lán)的陽極比其他濃度的亞甲基藍(lán)能夠更好地提高大腸桿菌MFC產(chǎn)電性能。輸出電壓、功率密度及極化曲線和循環(huán)伏安掃描等結(jié)果表明不同濃度亞甲基藍(lán)中能夠提高大腸桿菌MFC產(chǎn)電性能的最佳質(zhì)量濃度為0.06 g/L。

圖8 添加不同濃度亞甲基藍(lán)MFC實(shí)驗(yàn)組的循環(huán)伏安曲線Fig.8 Cyclic voltammogram of the MFC with different concentration of methylene blue

ρ(亞甲基藍(lán))/(g·L-1)00.020.040.060.080.10Pmax/(mW·m-2)18160184208178156表觀內(nèi)阻/Ω290159153140157172

3 結(jié)論

電子介體對于大腸桿菌BL21(DE3)的細(xì)胞毒性從高到低依次是甲基紫精、亞甲基藍(lán)、中性紅。

比較添加相同質(zhì)量濃度電子介體檢驗(yàn)大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產(chǎn)電性能、輸出電壓、功率密度、極化曲線和CV等，結(jié)果表明添加亞甲基藍(lán)對大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產(chǎn)電性能提高最為顯著。亞甲基藍(lán)的最佳添加質(zhì)量濃度為0.06 g/L，此時(shí)MFC能夠達(dá)到的最高穩(wěn)定電壓值為500 mV。