長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分

李明潔，楊波，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

長雙歧桿菌是在人體腸道微生物群中最廣泛存在的一種雙歧桿菌[1]，具有防治便秘[2]、抑制腸道致病菌[3]、調(diào)節(jié)腸道平衡、降低膽固醇[4]、促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、延緩衰老[5]和增強機體免疫活性[6-7]等生理功能。長雙歧桿菌可分為3個亞種，即長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種和長雙歧桿菌豬亞種[8]，這3個亞種在生理生化特性以及遺傳進化方面十分相近，常用的16S rRNA菌種鑒定的方法無法實現(xiàn)這3個亞種的區(qū)分[9-10]。目前多使用全基因組測序及系統(tǒng)發(fā)育樹[11-13]、PCR-RFLP[14]、PCR-DGGE[15]、多位點序列分析(MLSA)、擴增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)[16]、多位點測序分型(MLST)[17]等方法來區(qū)分不同亞種，但這些方法過程復雜，耗時長，成本高?！恫苁舷到y(tǒng)細菌學手冊》中記錄了長雙歧桿菌的不同亞種對碳水化合物利用能力存在顯著差異，這或許可作為區(qū)分不同亞種的依據(jù)。此外，利用基因型差異來區(qū)分亞種的方法也更加可靠，已有研究者嘗試采用特異性基因擴增的方法進行一些細菌的亞種區(qū)分，該方法過程簡單、快速，但需要找到能夠可靠區(qū)分不同亞種的特異性基因[18-21]。

因此，本研究擬利用碳水化合物利用譜測定、特異性基因擴增等手段，確認一種有效、快速、低成本的區(qū)分方法，以實現(xiàn)長雙歧桿菌的亞種區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

本文所用54株長雙歧桿菌,均保存于江南大學食品生物技術研究中心菌種庫(表1)。其中ATCC15697為長雙歧桿菌嬰兒亞種，13株已測定了基因組但亞種未知，其余40株亞種未知且無基因組序列。

表1 本文所用長雙歧桿菌Table 1Bifidobacterium longum in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基：用不同的碳水化合物(終質(zhì)量濃度為10 g/L)替代mMRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，并添加0.5%溴甲酚紫母液15 mL/L；

作為陰性對照培養(yǎng)基：mMRS培養(yǎng)基添加0.5%溴甲酚紫母液15 mL/L；

2×Taq Plus MasterMix,康為世紀生物科技有限公司；GeneRuler DNA Ladder Mix,英濰捷基；HGV-Ⅱ核酸染液,北京賽百盛基因技術有限公司；瓊脂糖,生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

AW500SG型Electrotek厭氧工作站，英國依萊泰科；GR60DA立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；C1000 TouchTM型基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；DYCP-31DN/DYCP-32B水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

采用orthomclV2.0.9軟件對不同菌株的直系同源基因進行分析[22-23]，根據(jù)同源基因分析結果，提取所有菌株的直系同源基因序列，利用mafft-7.313軟件對不同菌株的直系同源基因進行序列比對[22,24]，基于序列比對結果，進行進化分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株的活化

將保藏于甘油中的菌株劃線至mMRS固體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，后挑取單菌落接種至5 mL mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，液體連續(xù)活化2代。

通過實地調(diào)查研究表明，寧德市蕉城區(qū)水利風景區(qū)解說系統(tǒng)還處于初步原始階段，游客中心都尚未建成，入口標志，區(qū)域地圖，指示牌，警示牌等解說牌示缺乏，并且存在一定問題，可歸納如下：

1.3.3 碳水化合物利用能力比較

將200 μL不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基和陰性對照的培養(yǎng)基分裝于無菌96孔板中，分別接種2次活化后的2 μL菌液至96孔中，每個菌每種碳水化合物測2個平行孔，培養(yǎng)48 h后觀察孔板中培養(yǎng)基顏色變化及菌株生長情況。碳水化合物利用能力比較實驗重復3遍測定。

1.3.4 不同亞種的特異性基因分析

本文所有引物信息如表2所示。PCR反應體系(20 μL)：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，從變性到延伸需要重復30個循環(huán)，最后72 ℃補充延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀中觀察條帶情況。實驗重復3次確保引物具有良好的重復性。

表2 PCR引物Table 2 PCR primers

1.3.5 長雙歧桿菌菌株的亞種確認

利用亞種特異性引物對40株亞種未知的長雙歧桿菌進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物電泳后條帶情況區(qū)分長雙歧桿菌的不同亞種。并選擇擴增結果為嬰兒亞種的菌株送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行基因組草圖掃描，并構建系統(tǒng)進化樹，以驗證其為長雙歧桿菌嬰兒亞種。

2 結果與分析

2.1 13株已測基因組菌株的亞種確認

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取已確認亞種的長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種、長雙歧桿菌豬亞種菌株的基因組序列(各10個)，與本團隊前期已測全基因組但尚未確認亞種的13株長雙歧桿菌進行直系同源基因分析，共獲得核心基因941個，基于這些核心基因，構建了43株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

圖1 基于43株長雙歧桿菌核心基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 43 Bifidobacterium longumbased on core genes注：“■”為長雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”為長雙歧桿菌長亞種；“●”為長雙歧桿菌豬亞種；“★”為已測定全基因組但尚未確認亞種的長雙歧桿菌。

結果顯示，30株長雙歧桿菌不同亞種分別位于不同分支上，而本團隊前期已測基因組的13株菌分別屬于3個不同亞種，其中7株是長雙歧桿菌長亞種、5株為長雙歧桿菌嬰兒亞種、1株為長雙歧桿菌豬亞種。

2.2 不同長雙歧桿菌碳水化合物利用能力比較

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》及相關文獻報道[25-26]選擇了長雙歧桿菌不同亞種利用能力存在顯著差異的6種碳水化合物進行實驗，包括阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸鈉、甘露糖和巖藻糖，以進一步確認長雙歧桿菌不同亞種碳水化合物利用譜差異。

結果顯示，所測定的長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種、長雙歧桿菌豬亞種共14株菌利用不同碳水化合物產(chǎn)酸能力存在差異(表3)。3個亞種均可利用核糖和巖藻糖；長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌豬亞種不能利用葡萄糖醛酸鈉，而長雙歧桿菌嬰兒亞種FHeNJZ44M8、M2-03-F02-27和ATCC15697三株菌可利用葡萄糖醛酸鈉，其余3株卻不能利用；長雙歧桿菌長亞種中除FGZ16I1M5外，均可利用阿拉伯糖和木糖產(chǎn)酸。同一亞種的菌株利用同一種碳水化合物的能力存在差異，故根據(jù)不同碳水化合物利用能力的差異難以實現(xiàn)長雙歧桿菌不同亞種的區(qū)分。

表3 長雙歧桿菌不同亞種的碳水化合物利用比較Table 3 Carbohydrate utilization capacity of differentBifidobacterium longum strains

注：“+”代表菌株利用該碳水化合物產(chǎn)酸；“-”代表菌株未利用該碳水化合物產(chǎn)酸。

2.3 不同亞種的特異性基因分析

根據(jù)相關文獻報道選擇了9個亞種特異性基因(表2)，對14株亞種確認的長雙歧桿菌基因組DNA進行擴增，以評價這個特異性基因的有效性。MarR基因是長雙歧桿菌長亞種的特異性基因，理論擴增條帶為168 bp，但7株長雙歧桿菌長亞種的擴增結果顯示，僅CCFM762(圖2-b)、CCFM756(圖2-g)可成功擴增出168 bp的條帶，其余長亞種菌株無擴增產(chǎn)物；TerB基因的擴增結果也類似，僅CCFM685(圖2-c)、CCFM686(圖2-d)和FGZ16I1M5(圖2-f)可擴增出正確大小的條帶(156 bp)，其余長亞種菌株均沒有擴增產(chǎn)物，因此，這2個基因無法用于長雙歧桿菌長亞種的區(qū)分。盡管所有長亞種菌株可擴增出Sugarkinase基因(圖2)，嬰兒亞種菌株也不能擴增出該基因(圖3)，但豬亞種同樣擴增出該基因(圖4)，因此，該基因也無法區(qū)分長亞種和豬亞種，但可用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的確認。所有長亞種菌株(圖2)和豬亞種菌株(圖4)可擴增出長亞種Tuf基因，而嬰兒亞種菌株(圖3)也可擴增出條帶，該基因無法快速區(qū)分不同亞種。

a～g- FGZ6I1M6、CCFM762、CCFM685、CCFM686、CCFM752、FGZ16I1M5、CCFM756圖2 長雙歧桿菌長亞種菌株PCR電泳結果Fig.2 PCR electrophoresis results of B. longumsubsp. longum注：M- DNA Marker；1～9表示分別用MarR、TerB、lon、Blo、Glyoxalase、ABC、inf、Binf、Serine引物擴增。下同。

a～f- M2-03-F02-27、FHeNJZ44M8、ATCC15697、GZ17I1M1、GZ19I1M3、GZ23I1M2圖3 長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株PCR電泳結果Fig.3 PCR electrophoresis results of B. longumsubsp. infantis

圖4 長雙歧桿菌豬亞種菌株PCR電泳結果Fig.4 PCR electrophoresis results of B. longum subsp. suis

Glyoxalase基因是長雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，理論擴增條帶為168 bp，但6株長雙歧桿菌嬰兒亞種的擴增結果顯示，只有ATCC15697(圖3-c)可擴增出168 bp的條帶，其余嬰兒亞種菌株沒有擴增產(chǎn)物；ABC基因的結果也類似，M2-03-F02-27(圖3-a)沒有擴增產(chǎn)物，因此，這2個基因無法用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。Sialidase基因的擴增結果顯示，僅長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株可成功擴增得到正確大小的條帶(圖3)，而長雙歧桿菌長亞種(圖2)和長雙歧桿菌豬亞種(圖4)均無擴增產(chǎn)物，因此，Sialidase基因可用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。嬰兒亞種Tuf基因是長雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，該基因理論擴增條帶為123 bp，但所用14株菌的擴增結果顯示，長雙歧桿菌長亞種FGZ6I1M6(圖2-a)、CCFM685(圖2-c)、CCFM756(圖2-g)和長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株(圖3)均可以擴增出100 bp左右的條帶，因此，該基因的區(qū)分效果同樣不佳。而豬亞種的特異性基因Serine，理論擴增條帶為166 bp，但擴增結果顯示，CCFM688(圖4)沒有擴增產(chǎn)物，鑒于菌株數(shù)量太少，還需進一步確認。

為了解析不同基因擴增效果的差異，進一步利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)來分析引物的特異性(表4)。結果顯示，MarR和TerB的引物只能擴增出長雙歧桿菌長亞種菌株，但擴增出的菌株數(shù)較少，說明基因的特異性過強，可能不能廣泛區(qū)分長亞種；Sugarkinase和長亞種Tuf基因的引物可擴增出長雙歧桿菌長亞種和豬亞種，也就解釋了這兩個基因均無法實現(xiàn)長亞種和豬亞種的區(qū)分的原因，且長亞種Tuf基因可擴增出多個不同大小的片段；基因Glyoxalase和基因ABC Primer-BLAST只能擴增出部分長雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較強，不能廣泛用于區(qū)分嬰兒亞種；Sialidase基因可擴增出全部長雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較好；嬰兒亞種Tuf基因可擴增出全部長雙歧桿菌嬰兒亞種，但可擴增出多個不同大小的片段；基因SerinePrimer-BLAST只能擴增出部分長雙歧桿菌豬亞種，無法實現(xiàn)豬亞種的區(qū)分。

表4 特異性基因Primer-BLAST結果Table 4 The Primer-BLAST results of specific genes

注：表中數(shù)字為引物擴增出的菌株數(shù)占該亞種菌株總數(shù)的比例；“-”表示引物未擴增出該亞種菌株。

綜上可知，長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可有效實現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種與其他兩亞種的區(qū)分，根據(jù)擴增產(chǎn)物電泳后條帶的有無及大小初步實現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。若嬰兒亞種唾液酸酶基因擴增產(chǎn)物電泳后產(chǎn)生234 bp左右的條帶且長亞種糖激酶基因擴增產(chǎn)物電泳后無條帶產(chǎn)生，則該菌株可初步確認為長雙歧桿菌嬰兒亞種。

2.4 長雙歧桿菌嬰兒亞種的確認

采用上述區(qū)分效果較好的長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因進行PCR擴增，對40株亞種未知的長雙歧桿菌進行了PCR擴增，電泳后的條帶結果顯示，HeNJZ8M1、FJND16M4、JSSZ7M7、FHuNCS6M8和JSYC2M1共5株菌為長雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長雙歧桿菌長亞種或豬亞種(圖5)。

圖5 40株長雙歧桿菌PCR電泳結果Fig.5 PCR electrophoresis results of40 Bifidobacterium longum

為進一步驗證目前所確認亞種的準確性，從5株新確認的長雙歧桿菌嬰兒亞種中隨機選擇了4株，即HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4、JSSZ7M7寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行基因組草圖測序。并將上述4株菌與圖1中43株菌合并進行同源基因分析，共獲得938個核心基因?；谶@些核心基因，構建了該47株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。結果顯示，經(jīng)特異性基因擴增確認為長雙歧桿菌嬰兒亞種的4株菌(HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4和JSSZ7M7)確為長雙歧桿菌嬰兒亞種，進一步證實了基于長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因的特異性擴增可有效實現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。

圖6 基于47株長雙歧桿菌核心基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 47 Bifidobacteriumlongum based on core genes注：“■”長雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”長雙歧桿菌長亞種；“●”長雙歧桿菌豬亞種；“★”新確認的長雙歧桿菌嬰兒亞種。

3 結論

本研究對13株已測定基因組的長雙歧桿菌經(jīng)生物信息學分析確認了亞種，其中7株為長雙歧桿菌長亞種，5株為長雙歧桿菌嬰兒亞種，1株為長雙歧桿菌豬亞種。對亞種確認的長雙歧桿菌進行了碳水化合物利用譜比較，但碳水化合物利用譜難以實現(xiàn)不同亞種的區(qū)分。后采用特異性基因擴增的方法確認了長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可實現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分，并采用這對特異性基因從40株長雙歧桿菌中成功確認了5株長雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長雙歧桿菌長亞種或豬亞種，隨機選擇4株進行全基因組草圖測序，進一步分析證實確為長雙歧桿菌嬰兒亞種。遺憾的是，因長雙歧桿菌豬亞種可用菌株數(shù)量極少，長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌豬亞種的快速區(qū)分仍有待進一步完善。