一例雞源致病型大腸桿菌的分離鑒定

朱慶賀，王 爽，李文超，陳 曦，楊旭東，王觀悅，李 丹，史同瑞*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾161005；2.方正縣畜牧局，哈爾濱150800)

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)引起的各種急性或慢性疾病的總稱。不同品種及日齡的雞均可感染，尤其2～3周齡雛雞發(fā)病嚴(yán)重，病雞表現(xiàn)精神沉郁，腹瀉，關(guān)節(jié)有腫脹，氣囊炎等癥狀[1]。該病的發(fā)病率和死亡率高，暴發(fā)頻繁，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的發(fā)展。因此，集約化雞群養(yǎng)殖中常常使用抗生素來預(yù)防大腸桿菌病的發(fā)生[2]，抗生素的大量不合理使用導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，為大腸桿菌病的防治增加了難度。本研究自集約化養(yǎng)殖場的蛋雞中分離鑒定了一株致病型大腸桿菌，同時(shí)通過藥敏試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行了敏感藥物篩選，以期為雞場大腸桿菌病的抗生素治療提供藥物指導(dǎo)，避免無效抗生素的濫用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自黑龍江省拉哈鎮(zhèn)某蛋雞養(yǎng)殖場6月齡蛋雞，瀕死雞表現(xiàn)精神沉郁，腿部關(guān)節(jié)腫脹，排黃白色稀糞。死亡雞剖檢可見明顯的心臟纖維素沉積、包心包肝癥狀。

1.1.2 試劑與儀器 葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、尿素酶、吲哚、VP、MR、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等生化試劑，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Veriti96孔PCR儀購自美國Life ABI公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 2周齡雌性SPF雛雞10只，購自哈爾濱維科生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 無菌條件下取病死蛋雞的肝臟、脾臟，接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上，37 ℃ 條件下培養(yǎng) 24 h，再挑取菌落形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，純化3代后觀察單菌落細(xì)菌菌落形態(tài)，并挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。單個(gè)典型菌落接種普通肉湯增殖培養(yǎng)。

1.2.2 分離菌株生化試驗(yàn) 通過糖發(fā)酵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、MR 試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)進(jìn)行分離菌株生化特性檢測。

1.2.3 分離菌株的PCR擴(kuò)增和測序 以增殖的菌液為模板，用細(xì)菌 16S rDNA 的通用引物(表1)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為：模板 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，Premix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 分離菌株的同源性分析 將分離菌株的16S rDNA測序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，確定分離菌株的種屬。

1.2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) SPF雛雞致病性試驗(yàn)：取SPF雛雞10 只，隨機(jī)分成 2 組，每組 5 只，試驗(yàn)組分別用分離純化細(xì)菌肉湯進(jìn)行頸部皮下注射，每只雛雞接種上述細(xì)菌 0.5 mL (大腸桿菌濃度為3.0 × 109CFU/mL)，對(duì)照組每只接種生理鹽水0.5 mL，觀察細(xì)菌致病性情況，雛雞死亡后剖檢，對(duì)死亡雛雞心臟、肝臟組織涂片染色鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 將稀釋好的菌液每個(gè)平板接種0.1 mL，用滅菌玻璃棒涂勻整個(gè)平板表面，用無菌鑷子取10種藥敏紙片貼于平板上，每個(gè)平板貼5張紙片，相隔不少于 3 cm，將上述平板置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后觀察結(jié)果并測量各紙片周圍抑菌圈直徑(mm)，參照EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)(2016)標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性 麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)小粉紅色；伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤形態(tài)；在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、圓形、整齊、隆起的菌落。

2.2 染色鏡檢 分離菌株革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓，與大腸桿菌染色特性相符。

2.3 生化試驗(yàn)鑒定 分離菌株能發(fā)酵乳糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵麥芽糖、甘露醇，吲哚試驗(yàn)為陽性，VP 試驗(yàn)為陰性，尿素酶陰性，MR試驗(yàn)陽性，與大腸桿菌生化特性相符(表2)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of biochemical test

“+”表示陽性，“-”表示陰性，“?”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣
" +" means positive，" -" means negative，" ?" means acid producing gas

2.4 PCR鑒定 分離菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，得到大小為1457 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)期大小一致，目的片段送吉林庫美生物有限公司測序。

1.M.DL-2 000 Marker;2.陰性對(duì)照;3.分離菌;4.陽性對(duì)照1.M.DL-2 000 Marker;2.Negative control;3.Isolated bacteria;4.Positive control圖1 細(xì)菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 1 Results of bacterial 16S rDNA agarose gel electrophoresis

2.5 測序分析 16SrDNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明(表3)，分離菌16SrDNA測序片段與Genbank中已知10株大腸桿菌菌株的同源性均在99%以上，因此，確定分離菌株為大腸桿菌菌株。

表3 分離菌株序列同源性分析Table 3 Analysis of sequence homology of isolated strain

2.6 雛雞致病性試驗(yàn)結(jié)果 SPF雛雞頸部皮下接種后 12 h 全部開始發(fā)病，出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，肛門周圍有污穢物，48 h內(nèi)全部死亡。剖檢死亡雛雞發(fā)現(xiàn)氣管支氣管粘液增加(圖2 A)；雛雞少量心包積液，肝臟腫脹，有出血點(diǎn)及出血斑，質(zhì)地變脆(圖2 B)；十二指腸出血(圖2 C)。雛雞的心臟和肝臟組織中均可見所接種的細(xì)菌(圖2 D，100 x)。

圖2 致病性試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Results of attack test

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)已鑒定出的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表4。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離鑒定出的大腸桿菌對(duì)丁胺卡那敏感性較高，多粘菌素次之。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of Antimicrobial test susceptibility test

R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感

3 討論與結(jié)論

通過細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)考察以及PCR鑒定等，確定從死亡蛋雞中分離得到菌株為大腸桿菌，動(dòng)物致病性試驗(yàn)證實(shí)，分離菌株具有強(qiáng)致病性。藥敏試驗(yàn)證實(shí)，分離菌株對(duì)青霉素、氟苯尼考、慶大霉素、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢唑啉、紅霉素等臨床上常用多種抗生素耐藥，僅對(duì)丁胺卡那霉素和多粘菌素較為敏感。這一結(jié)果與已報(bào)道黑龍江地區(qū)鵝源大腸桿菌藥敏結(jié)果較為相似[4]，證明臨床中禽源大腸桿菌耐藥性情況非常嚴(yán)重，有必要通過藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥物篩選使用，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選最敏感的藥物和最合適的劑量，切忌盲目用藥，濫用藥，否則耐藥情況很可能進(jìn)一步加重。

與國外相比，我國的大腸桿菌分離株存在著明顯的地域性和多樣性，致病型血清型數(shù)量較大，雞源致病型大腸桿菌血清型多集中在O1、O2、O78等型，鄧彥宏等在東北地區(qū)(黑龍江，吉林，遼寧)分離得到219株大腸桿菌，共鑒定了189個(gè)分離株的血清型，其中O1、O4、O78、O138、O107、O141檢出率較高，證明這些血清型為東北地區(qū)的流行優(yōu)勢(shì)血清型[5]，本研究并未進(jìn)行大腸桿菌的血清型檢測，但測序結(jié)果表明，分離株與O1血清型CLSC36 株同源性最高，為99.5%，這一結(jié)果與已報(bào)道流行大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型結(jié)果一致，說明O1型大腸桿菌在黑龍江地區(qū)存在流行，并且耐藥性較高，本研究中丁胺卡那霉素和多粘菌素對(duì)其較為敏感，此結(jié)果對(duì)黑龍江省雞源致病型大腸桿菌的防治有一定的參考意義。

大腸桿菌病的控制主要以預(yù)防為主，但如果出現(xiàn)發(fā)病，抗生素治療仍是目前最有效的治療方式。隨著蛋雞、肉雞集約化養(yǎng)殖的增加，飼喂抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療大腸桿菌病已成為集約化養(yǎng)殖過程中必不可少的程序[2]，不合理使用抗生素必然導(dǎo)致大量細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[6]，為此獸醫(yī)主管部門已經(jīng)提出了減量化使用抗生素的倡議。最為行之有效的辦法仍然是找到一種可以代替抗生素治療細(xì)菌性疾病的替代品。應(yīng)用疫苗和生物制劑防控大腸桿菌病被認(rèn)為是一種良好防控措施[7-8]。益生菌的發(fā)現(xiàn)也為耐藥菌治療提供了機(jī)會(huì)[9]。而中草藥及中藥復(fù)方制劑因其療效好、低殘留、不宜產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，成為近年來的研究熱點(diǎn)[10]，但目前上述方法仍不能完全取代抗生素的作用，因此，還應(yīng)進(jìn)一步探索研究，為真正做到抗生素減量化使用奠定基礎(chǔ)。