• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      PK15細(xì)胞的無血清全懸浮馴化研究

      2019-10-14 01:22:02劉天倫郎洪彬
      中國獸藥雜志 2019年9期
      關(guān)鍵詞:傳代貼壁消化

      劉天倫,郎洪彬,孔 颯

      (1.北京民海生物科技有限公司,北京102609;2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司,北京102609)

      豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的病毒性傳染病。研究結(jié)果表明,PCV2感染除了造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS),同時還與豬呼吸道綜合癥(PRDC)、豬皮炎和腎病綜合征(PNDS)、先天性震顫、繁殖障礙、胎兒心肌炎和擴(kuò)張性壞死性肺炎等豬圓環(huán)病毒病(PCDAD)密切相關(guān)[1],給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。王貴華等[2]已經(jīng)用PK15細(xì)胞成功分離了豬圓環(huán)病毒2型。PK15為豬腎上皮細(xì)胞,對豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬瘟病毒(CSFV)等多種病毒比較敏感[3]。PK15細(xì)胞現(xiàn)已用于PCV2的生產(chǎn),但由于PCV2體外增殖能力較差,致使PCV2效價不高。因此,PCV2的滴度問題一直是PCV2培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵[4]。生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是提升細(xì)胞密度的核心技術(shù),其中微載體技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)之一。何錫忠等[5]利用微載體技術(shù)培養(yǎng)PK15細(xì)胞生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型,任麗[6]用生物反應(yīng)器對PCV2的微載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。但由于微載體培養(yǎng)系統(tǒng)不適合于對剪切力較敏感的細(xì)胞,且存在微載體價格昂貴,重復(fù)利用效果不好,細(xì)胞制備需求量過大等缺點(diǎn),馴化一株可適應(yīng)大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)的全懸浮PK15細(xì)胞可推進(jìn)工藝的進(jìn)一步升級。全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有細(xì)胞密度大、放大倍數(shù)大、傳代方便等優(yōu)勢,但是對攪拌和氣體的剪切力非常敏感,對反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)有較高的要求。無血清培養(yǎng)是通過用已知的人源或者動物源的蛋白或生長因子、激素來代替動物血清的一種培養(yǎng)方式,可減少后期純化工作的難度,提高產(chǎn)品質(zhì)量[7]。本研究對一株貼壁的PK15進(jìn)行了無血清的全懸浮馴化,以期為大規(guī)模培養(yǎng)豬圓環(huán)2型病毒提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 細(xì)胞和毒株 PK15細(xì)胞(豬圓環(huán)病毒1型陰性、豬肺炎支原體陰性)由大北農(nóng)動物醫(yī)學(xué)研究中心保存。

      1.1.2 主要試劑和耗材 DMEM-F12(12500-096)、0.25%胰蛋白酶(27250-018)、optiPROTM-sfm(12309019)購自Gibco公司,無血清懸浮培養(yǎng)基PK15-H(M20317)購自上海源培生物有限公司,新生牛血清(04-102-1A)購自BI公司,臺盼藍(lán)(T8154)購自美國Sigma公司,細(xì)胞方瓶、搖瓶、96孔板購自美國康寧公司。

      1.1.3 主要儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司,軌道式振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司,倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司,Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司,SBA生物傳感器購自山東省科學(xué)院生物研究所,低速冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司。

      1.2 方法

      1.2.1 PK15細(xì)胞無血清全懸浮馴化

      1.2.1.1 PK15貼壁細(xì)胞降血清 復(fù)蘇一支PK15細(xì)胞,用含8%新生牛血清(NBS)的DMEM-F12按照常規(guī)傳代方法傳代,在75 cm2方瓶中傳3代至細(xì)胞密度穩(wěn)定后,按初始密度0.25×106/mL分別接種至2個75 cm2方瓶中,其中一瓶用含有1/4體積的optiPROTM-sfm和3/4體積的加入8% NBS的DMEM-F12的混合培養(yǎng)基培養(yǎng),用于降血清;另外一瓶用全體積的加入8% NBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),作對照細(xì)胞,培養(yǎng)體積均為30 mL。

      表1 降血清方法和代次Tab 1 Method and Generation of reduced serum

      1.2.1.2 PK15貼壁細(xì)胞低血清的懸浮馴化 細(xì)胞適應(yīng)低血清貼壁培養(yǎng)至密度穩(wěn)定3代后,消化后將細(xì)胞懸液離心去除胰酶,移至125 mL搖瓶中。培養(yǎng)體積根據(jù)初始密度一般在20~40 mL之間,初始密度1.0×106/mL,培養(yǎng)基比例由1/2optiPROTM-sfm和1/2 PK15-H過渡到1/3optiPROTM-sfm和2/3PK15-H再過渡到全PK15-H,血清含量為2%。傳代時間根據(jù)細(xì)胞密度決定,一般保證傳代前細(xì)胞密度大于2.0×106/mL,繼續(xù)消化連續(xù)傳代,至細(xì)胞密度穩(wěn)定。

      1.2.1.3 PK15懸浮無血清的馴化 含2%NBS的全懸浮PK15細(xì)胞傳代時,成團(tuán)現(xiàn)象較為嚴(yán)重,需去除大團(tuán)并連續(xù)消化傳代。降血清由2%降到1%,再由1%降至0.5%,再降至無血清,降血清過程中細(xì)胞密度穩(wěn)定2~3代后方可進(jìn)行下一步傳代。傳代時間根據(jù)細(xì)胞密度而定,傳代前密度一般大于2.0×106/mL,傳代后初始密度一般在1.0×106/mL左右。

      1.2.2 PK15-S增值的穩(wěn)定性 取馴化后細(xì)胞進(jìn)行初始密度為0.5×106/mL的連續(xù)傳代,每24 h取樣觀察計(jì)數(shù),72 h開始傳代。細(xì)胞懸液離心后取上清液,按照SBA生物傳感器操作規(guī)程,10倍稀釋上清液后,測定糖和乳酸含量,并記錄。

      1.2.3 細(xì)胞密度測定方法 采用臺盼藍(lán)(TB)染色法計(jì)算細(xì)胞密度,具體操作如下:先用無菌PBS稀釋臺盼藍(lán),稀釋比例1∶1,再用稀釋過的臺盼藍(lán)稀釋細(xì)胞懸液,稀釋比例1∶1,最終稀釋后,吹打均勻,取40 μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中,放入Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù),一個樣品取3個視野,取平均值,即為細(xì)胞密度。

      1.2.4 PK15-S倍增時間的測定 取馴化傳代穩(wěn)定的細(xì)胞,每天取樣計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞生長曲線,計(jì)算細(xì)胞倍增時間。取馴化傳代穩(wěn)定細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長時間(T)計(jì)算細(xì)胞倍增時間Δt,計(jì)算公式如下:

      Δt=T/AA=log2Y/X

      2 結(jié)果與分析

      2.1 無血清懸浮PK15細(xì)胞生長情況分析

      2.1.1 PK15貼壁細(xì)胞降血清 逐步降血清與高血清對照最高密度的對比結(jié)果見表2。在含有9/10體積的optiPROTM-sfm和1/10體積的加入8% NBS的DMEM-F12的混合培養(yǎng)基時細(xì)胞密度也高于高血清密度,即0.8%血清量。當(dāng)全用optiPROTM-sfm養(yǎng)時,細(xì)胞密度低于高血清的密度,由此可初步將馴化前期血清量控制在1%~2%。

      表2 PK15貼壁細(xì)胞降血清密度情況Tab 2 Reduction of serum density by PK15 adherent cells

      48 h或72 h取樣為消化后體積,細(xì)胞懸液為10 mL;表格中DMEM-F12均加入8% NBS

      2.1.2 PK15貼壁低血清的懸浮馴化 由于細(xì)胞直接由貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)至全懸浮狀態(tài),細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象較為嚴(yán)重,以致于每次傳代必須經(jīng)過消化才能傳代,傳代需經(jīng)過離心去上清、胰酶震蕩消化、離心去胰酶、培養(yǎng)基吹打均勻繼續(xù)培養(yǎng)4個步驟,密度情況見表3。團(tuán)塊較大時,可配制高濃度胰酶進(jìn)行消化,期間操作時間較長且步驟多,對細(xì)胞造成損傷較為嚴(yán)重并且易污染,前期細(xì)胞活率不是很高但可以接受,后期轉(zhuǎn)為正常。

      表3 PK15貼壁低血清的懸浮馴化密度情況Tab 3 Suspension acclimation density of PK15 adherent low serum

      細(xì)胞經(jīng)過9個代次,3種組合培養(yǎng)基的過渡傳代,細(xì)胞漲勢較好,但存在較大團(tuán)塊,消化后分散均勻(圖1),且活率保持在95%以上,需進(jìn)一步降血清馴化。

      圖1 PK15貼壁低血清的懸浮馴化細(xì)胞狀態(tài)Fig 1 Suspension domesticated cell state of PK15 adherent low serum

      2.1.3 PK15懸浮無血清的馴化 血清的存在也是細(xì)胞成團(tuán)的主要因素之一,血清濃度由2%降到1%,再由1%降至0.5%,再降至無血清,細(xì)胞密度波動較為明顯,消化后計(jì)數(shù),活率都能有95%以上,若細(xì)胞團(tuán)塊過大還仍用合適濃度的胰酶進(jìn)行消化后再計(jì)數(shù),否則計(jì)數(shù)誤差會很大。

      PK15懸浮細(xì)胞經(jīng)過9個代次的降血清實(shí)驗(yàn)(表4),細(xì)胞在無血清條件下輪廓清晰,分散均勻,大小均一性良好(圖2),密度穩(wěn)定。該株貼壁PK15細(xì)胞,從復(fù)蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細(xì)胞,經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的過渡(表5),共23次傳代(圖3、圖4),細(xì)胞狀態(tài)良好,活率較高,可凍存保種。

      表4 PK15懸浮無血清的馴化密度情況Tab 4 Domestication density of PK15 suspension without serum

      圖2 PK15懸浮無血清的馴化細(xì)胞狀態(tài)Fig 2 State of domesticated cells in PK15 suspension without serum

      培養(yǎng)方法血清含量傳代次數(shù)培養(yǎng)容器接種密度/mL培養(yǎng)時間細(xì)胞數(shù)量/mL細(xì)胞活率結(jié)團(tuán)情況低血清貼壁8%~2%5T750.25×10648h0.97×106/少量低血清懸浮2%9搖瓶1×10648h3.79×10696%多且大無血清懸浮2%~0%9搖瓶1×10648h3.89×10697%無

      圖3 貼壁培養(yǎng)階段PK15細(xì)胞密度情況Fig 3 The density of PK15 cells in the adherent culture stage

      圖4 懸浮培養(yǎng)階段PK15細(xì)胞密度及活率情況Fig 4 Density and survival rate of PK15 cells in suspension culture stage

      2.2 PK15-S增值的穩(wěn)定性 為了驗(yàn)證該馴化細(xì)胞的穩(wěn)定性,本實(shí)驗(yàn)又將馴化后凍存細(xì)胞再次復(fù)蘇,并按初始密度0.5×106/mL連續(xù)傳11代,同時對糖和乳酸含量進(jìn)行檢測,結(jié)果見表6。

      2.3 PK15-S倍增時間的測定 取馴化穩(wěn)定細(xì)胞,培養(yǎng)至144 h,每24 h取樣計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞生長曲線(圖5);根據(jù)該曲線計(jì)算細(xì)胞倍增時間為22.7 h。

      表6 PK15-S細(xì)胞生長情況Tab 6 PK15-S Cells growth situation

      圖5 PK15-S細(xì)胞生長趨勢圖Fig 5 PK15-S cell growth trend graph

      3 討論與結(jié)論

      PK15細(xì)胞主要用于生產(chǎn)PCV2型和豬細(xì)小病毒,近年來,培養(yǎng)方式也逐漸由滾瓶系統(tǒng)提升為微載體系統(tǒng),但目前仍有少部分生產(chǎn)廠家沿用滾瓶系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng),滾瓶培養(yǎng)的主要缺點(diǎn)是勞動強(qiáng)度大,比表面積小,占用空間大,培養(yǎng)條件難以檢測和控制[7]。通過生物反應(yīng)器運(yùn)用微載體系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)改進(jìn)了滾瓶培養(yǎng)模式的不足。張立等[8]運(yùn)用球轉(zhuǎn)球的方法成功將Vero細(xì)胞由5 L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)至50 L生物反應(yīng)器。但是,大部分微載體放大培養(yǎng)需要用胰酶進(jìn)行消化,消化后的細(xì)胞存在貼壁時間不同的現(xiàn)象,消化后的微載體與新加入的微載體表面存在差異,兩種因素均會造成細(xì)胞再次貼壁的不均勻,從而影響產(chǎn)毒結(jié)果;并且微載體存在價格昂貴,重復(fù)利用效果不好,貼壁條件苛刻,暴露環(huán)節(jié)多等劣勢。兩種培養(yǎng)方式均需要有牛血清的添加,增加成本的同時也給下游純化工作帶來一定的麻煩,所以馴化一株無血清全懸浮PK15細(xì)胞可以提升培養(yǎng)工藝,也使培養(yǎng)方法更簡單,操作性更高。

      該株P(guān)K15細(xì)胞,從復(fù)蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細(xì)胞,經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的馴化,共23個代次的傳代,細(xì)胞狀態(tài)良好,馴化過程中偶有接團(tuán)現(xiàn)象,細(xì)胞活率較高,最高密度可達(dá)4.0×106/mL左右,倍增時間在24 h左右。

      馴化過程中,由于細(xì)胞生長方式的改變,細(xì)胞會以相互聚集即成團(tuán)的現(xiàn)象生長,消化傳代可以改善成團(tuán)問題,也可以添加一些除團(tuán)的組分來除團(tuán)。同一種病毒對同一細(xì)胞的不同克隆株的敏感性不同,同一細(xì)胞所處外環(huán)境不同,同一病毒的敏感性也會有所差異[9],為了避免做無用功,定期的檢測細(xì)胞對毒的敏感性是很關(guān)鍵的。另外,在細(xì)胞馴化過程中及時的凍存細(xì)胞也是很重要的,因?yàn)轳Z化過程中操作步驟多,污染風(fēng)險(xiǎn)大,及時保種可以避免重復(fù)工作。

      無血清全懸浮的培養(yǎng)工藝優(yōu)勢在于細(xì)胞密度大,操作方便,對于非CPE病毒可采用半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)收獲病毒,提高了產(chǎn)量降低了成本,血清的去除減輕了下游工藝的工作壓力,但全懸浮細(xì)胞對培養(yǎng)基的成分和攪拌式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)要求較高,對剪切力也非常敏感,常添加PF-68等表面活性劑來保護(hù)細(xì)胞達(dá)到所需密度,在今后的大規(guī)模生產(chǎn)中仍需對培養(yǎng)條件進(jìn)行更深入的研究。

      猜你喜歡
      傳代貼壁消化
      嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對其益生特性及貨架期菌數(shù)的影響
      高硫煤四角切圓鍋爐貼壁風(fēng)傾角對水冷壁 高溫腐蝕影響研究
      “胃不舒服”未必都是消化問題
      祝您健康(2022年2期)2022-01-14 16:43:15
      具有一般反應(yīng)函數(shù)與貼壁生長現(xiàn)象的隨機(jī)恒化器模型的全局動力學(xué)行為
      塞尼卡病毒A在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)條件探索
      660MW超超臨界鍋爐高速貼壁風(fēng)改造技術(shù)研究
      能源工程(2021年2期)2021-07-21 08:39:58
      食物是怎么消化的
      小布老虎(2017年4期)2017-08-10 08:22:40
      微生物實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析
      急診消化內(nèi)科上消化道出血治療
      體外全骨髓貼壁法培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
      胶南市| 巍山| 古交市| 滨州市| 曲麻莱县| 青铜峡市| 博湖县| 巴塘县| 柘城县| 河曲县| 大关县| 西吉县| 忻城县| 无极县| 清水河县| 攀枝花市| 江油市| 梅州市| 简阳市| 都匀市| 郯城县| 左贡县| 普兰县| 松江区| 岳普湖县| 闽清县| 华安县| 吉木萨尔县| 乌苏市| 清镇市| 炉霍县| 青阳县| 彭水| 遂平县| 平阳县| 临漳县| 马山县| 古田县| 桐城市| 札达县| 古浪县|