土霉素在雞蛋中的殘留消除研究

張崇威，邱瑾麗，李紅嬌

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州福源動物藥業(yè)有限公司，鄭州 450001)

鹽酸土霉素可溶性粉為四環(huán)素類廣譜抗菌藥物制劑，能迅速抑制細菌的生長繁殖。臨床上常用于治療豬、雞敏感大腸埃希菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及支原體引起的感染性疾病。鹽酸土霉素可溶性粉可用于產(chǎn)蛋期，治療產(chǎn)蛋率下降或停止產(chǎn)蛋，以及因輸卵管炎造成的蛋殼上帶有血跡、產(chǎn)畸形蛋和軟殼蛋、輸卵管排出黃白色膿樣分泌物等[1]。根據(jù)在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的調(diào)查，養(yǎng)殖場常以高于常規(guī)劑量給藥，給藥劑量為667 mg/L 50%鹽酸土霉素可溶性粉，飲水給藥，高于國家規(guī)定的500 mg/L給藥劑量。人體長期攝入含少量抗生素的食品后，會造成藥物的蓄積，產(chǎn)生毒性作用，嚴重的會出現(xiàn)致癌、致畸、致突變等，因此，對食品安全帶來極大的潛在危害[2]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定了土霉素在雞蛋中的最高殘留限量標準為200 μg/kg，棄蛋期2 d。目前，我國關(guān)于雞蛋中土霉素的研究主要針對殘留檢測方法的研究，包括超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、高效液相色譜法[4]、固相萃取-高效液相色譜法[5]、毛細管電泳-電化學(xué)檢測法[6]等，尚未見關(guān)于鹽酸土霉素可溶性粉按國家規(guī)定劑量和增加劑量使用后在雞蛋中殘留消除規(guī)律的研究，本試驗通過研究鹽酸土霉素可溶性粉在雞蛋中的殘留情況，確定棄蛋期前后土霉素殘留量，以期為蛋雞產(chǎn)蛋期安全用藥，保障食品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 土霉素對照品，批號：130305，中國食品藥品檢定研究院；鹽酸土霉素可溶性粉，規(guī)格：50%，生產(chǎn)批號：201708003，鄭州福源動物藥業(yè)有限公司蘇可樂(批準文號：獸藥字160256691)；甲醇，乙腈為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉為分析純，超純水，所需溶液配制見GB/T 21317[7]。

1.2 主要儀器 Acquity UPLC-XEVO TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；3K-30臺式高速冷凍離心機(Sigma公司)；R215 Professional旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；IKAMS3.Basic圓周振蕩器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)；ALC-2100.2電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DCⅡ氮氣吹干儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；TD系列固相萃取柱，TD-TPS-00603(天津市興達科技有限公司)。

1.3 試驗動物及分組 試驗選用三棚蛋雞，品種為京紅，362日齡，購自山西省陽城縣浩博養(yǎng)殖有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)，進行常規(guī)免疫程序，試驗前不使用任何藥物。三棚蛋雞隨機分為空白對照組(15000只)，常規(guī)劑量組(14000只)，加大劑量組(15000只)。飼喂不添加任何抗菌藥物的全價飼料，自由采食飲水。試驗前后各組蛋雞飼養(yǎng)條件相同。

1.4 給藥和樣品采集 常規(guī)劑量組以500 mg/L，加大劑量組667 mg/L集中飲水給藥5 d，空白對照組不給藥。根據(jù)農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)醫(yī)發(fā)[2018]2號中畜禽產(chǎn)品獸藥殘留抽樣要點[8]，在停藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，每個時間點分別從不同劑量組的雞棚前中后位置的產(chǎn)蛋架隨機采集雞蛋，每個時間點10個樣本，每個樣本10枚雞蛋。樣本標記，冰箱4 ℃保存，待測。

1.5 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1×100 mm)；柱溫30 ℃；流動相A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；進樣量5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1為即時變化，6為線性變化

1.6 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣容量800 L/h；錐孔電壓25 V；錐孔氣流速150 L/h；毛細管電壓3.3 kV；定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone volt and collision enerey

1.7 樣品前處理 用勻漿機把雞蛋制成勻漿，稱取勻質(zhì)樣品(2±0.02)g，置50 mL離心管中，加入16 mL緩沖液，漩渦震蕩20 min，14000 r/min低溫離心5 min，靜置，取上清液8 mL進行樣品凈化。HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上述雞蛋待凈化的8 mL上清液注入萃取柱中，分別依次用3 mL水、3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液后，用3 mL甲醇洗脫，洗脫液50 ℃水浴中氮氣儀吹干，殘渣用1 mL 30%甲醇溶液復(fù)溶，充分混勻，殘渣溶液過0.22 μm針頭式過濾器后，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，若殘留量超出曲線范圍，以相應(yīng)空白基質(zhì)稀釋至曲線范圍。

1.8 標準曲線 分別精密吸取100 μg/L的土霉素標準中間液0.02、0.05、0.08、0.10、0.20 mL于1.7項中氮氣吹干后所得殘渣，加30%甲醇溶液0.98、0.95、0.92、0.90、0.80 mL，混勻，制成2、5、8、10、20 μg/kg的系列基質(zhì)標準溶液，依次上機，以土霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.9 檢測限和定量限 取勻漿后空白雞蛋樣品2 g，添加適量的土霉素標準溶液，按照1.7項進行處理，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，按信號(S)與噪音(N)比值計算，S/N>3為檢測限，S/N>10為定量限值。

1.10 精密度和準確度 分別取勻漿后空白雞蛋樣品2 g，添加4、200、400 μg/kg水平的土霉素進行回收率試驗(按照1.7項進行處理)，每個添加水平6個平行，連做3次，并計算日內(nèi)相對標準偏差及日間相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 土霉素在2～20 μg/kg濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其曲線方程為：y=17489.07447X-2109.07021，相關(guān)系數(shù)r為0.99968，如圖1所示。標準溶液圖譜如圖2。

圖2 雞蛋基質(zhì)中10 μg/kg土霉素標準液的特征色譜圖Fig 2 chromatogram of 10 μg/kg oxytetracycline standard solution in egg matrix

2.2 檢測限和定量限 根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N>3為檢測限，S/N>10為定量下限，得雞蛋中土霉素的檢測限為 2 μg/kg，定量限為 4 μg/kg。

2.3 準確度和精密度 土霉素在4、200、400 μg/kg 3個添加水平上，每個添加水平做6平行，其平均回收率、日內(nèi)相對標準偏差及日間相對標準偏差見表3。土霉素的回收率在79.1%～93.6%之間，日內(nèi)相對標準偏差及日間相對標準偏差均小于10%。圖3為空白雞蛋的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖，圖4為空白雞蛋中添加10 μg/kg的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖。

表3 土霉素回收率及相對標準偏差實驗(n=6)Tab 3 Test of recovery rate and relative standard deviation(RSD)of Oxytetracycline(n=6)

圖3 空白雞蛋的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3 The characteristicion quality chromatogram of oxytetracycline in blank eggs

圖4 空白雞蛋中添加10 μg/kg土霉素的特征色譜圖Fig 4 Chromatogram of oxytetracycline (10 μg/kg)in blank eggs

2.4 雞蛋中土霉素的殘留消除 按照前處理方法對所采集的雞蛋中土霉素殘留進行檢測，外標法定量。不同采樣點土霉素殘留量見表4，殘留消除曲線如圖5。

表4 高低劑量組雞蛋中的土霉素殘留量 Tab 4 Oxytetracycline residues in Eggs in high and low dose

圖5 雞蛋中土霉素殘留消除曲線Fig 5 Depletion curve of oxytetracycline residue in egg

空白對照組試驗期間與各試驗組飼養(yǎng)條件和采樣時間點相同，空白對照組樣品在各取樣時間點均未檢測出土霉素殘留，表明實驗動物在試驗期間未受到其他來源藥物的影響，實驗動物在試驗期間土霉素殘留均來源于目的性給藥。表4結(jié)果顯示，蛋雞產(chǎn)蛋期分別按500 mg/L和667 mg/L劑量，連續(xù)5 d，每天1次，集中飲水給藥50%鹽酸土霉素可溶性粉。低劑量組在停藥第1天，土霉素殘留量最高，達到142.72 μg/kg，高劑量組殘留量為74.71 μg/kg，高劑量組在停藥第2天殘留量最高，82.84 μg/kg，與我國規(guī)定的棄蛋期2 d符合。高、低劑量組在停藥后的1～12 d，雞蛋中的土霉素殘留量均低于國家農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定的最高殘留限量(200 μg/kg)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，P>0.05，兩組差異不顯著。在臨床病情嚴重時，按標簽最大劑量的1.33倍給藥后，不會造成土霉素在雞蛋中殘留量超標。

3 討 論

3.1 藥物劑量的選擇 鹽酸土霉素可溶性粉是我國極少數(shù)可用于蛋雞的廣譜抗生素，因此，在臨床中常用于治療蛋雞的輸卵管炎。50%鹽酸土霉素可溶性粉根據(jù)《獸藥質(zhì)量標準》(2017年版)化學(xué)藥品卷[9]中用法用量為，以本品計每1 L水雞300～500 mg，連用3～5 d。因此,本試驗選用標簽中最大使用濃度500 mg/L作為常規(guī)劑量組，由于臨床使用過程中存在加大藥物使用劑量現(xiàn)象，經(jīng)在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中現(xiàn)場調(diào)查，加大劑量一般為667 mg/L(每150 kg水100 g本品)，因此，選用667 mg/L作為加大劑量組，經(jīng)集中飲水給藥途徑，連用5 d，研究土霉素在雞蛋中的殘留水平。

3.2 藥物在雞蛋中的殘留情況 試驗選用的兩個劑量是鹽酸土霉素可溶性粉在臨床治療輸卵管炎常用劑量，在大群養(yǎng)殖環(huán)境中，蛋雞通過集中飲水給藥，土霉素殘留情況與試驗室研究存在一定差異。低劑量組與高劑量組在停藥3 d殘留量比停藥1 d分別下降了59.4%和20.4%，并且殘留量均較低，說明土霉素在蛋雞體內(nèi)的代謝速率相對較快，我國規(guī)定雞蛋中土霉素的最高殘留限量(MRL)標準為200 μg/kg，停藥3 d低、高劑量組土霉素在雞蛋中殘留量僅為最高殘留限量標準的29%，兩個劑量組均不會造成土霉素殘留超標。

3.3 檢測結(jié)果 不同給藥濃度雞蛋中殘留量也不同，停藥第1天，常規(guī)劑量組的殘留量高于高劑量組，停藥第2天開始，常規(guī)劑量組的檢出值均低于高劑量組。國內(nèi)文獻[10]曾報道高劑量組在雞蛋中的殘留量比低劑量組先達到高峰。本試驗兩個劑量組的土霉素殘留量在停藥后的12 d中，藥物的殘留量均出現(xiàn)往復(fù)現(xiàn)象，如低劑量組停藥第6天的殘留量19.34 μg/kg，停藥第7天的殘留量25.83 μg/kg，高劑量組停藥第6天的殘留量20.48 μg/kg，停藥第7天的殘留量30.86 μg/kg。與國外文獻[11]報道相似：對羅德島紅雞通過飲水給予400、600、800 mg/L土霉素連續(xù)7 d，400和600 mg/L劑量組的蛋黃中土霉素殘留量在停藥第3、4天，也出現(xiàn)了殘留量升高的現(xiàn)象。

土霉素在雞蛋中殘留量出現(xiàn)往復(fù)的原因，一是由于雞蛋結(jié)構(gòu)的特殊性，藥物向蛋黃中的移行過程是向細胞內(nèi)蓄積的過程，蛋黃中的藥物殘留反映了卵泡快速生長期(10 d)血漿的藥物水平，蛋黃中的藥物殘留水平因用藥時間長短和開始用藥時間處于卵泡生長的不同階段而升高、穩(wěn)定或下降[12]，因此,雞蛋中藥物殘留量出現(xiàn)波動。第二個原因Kan等[13]推測是受藥物與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合率的影響，該研究在母雞的峽部和輸卵管的膨大部檢測到四環(huán)素類藥物，且四環(huán)素在輸卵管和蛋白中的殘留水平高于血液中的藥物水平，等血液中藥物濃度下降后，與蛋白質(zhì)結(jié)合的部分藥物會重新釋放出來進入雞蛋，這也會使雞蛋中四環(huán)素類藥物的殘留量發(fā)生變化。本試驗中土霉素在雞蛋中的殘留量雖然在后期有上升趨勢，但幅度較小，遠低于國家農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定的土霉素最高殘留限量(200 μg/kg)，不會造成土霉素殘留量超標。