包永華，王璐璐

(1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院，杭州 310018；2.浙江方圓檢測集團股份有限公司，杭州 310013)

硝基呋喃類藥物(呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林)是一類人工合成的具有硝基呋喃基本結構的廣譜抗生素，曾廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、潰瘍等[1]。該類藥物及其代謝物具有潛在的致癌、致畸、致突變等毒副作用,因而引起人們的高度重視[2-3]。目前，全球大多數(shù)國家均將其列為禁用藥物，硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留是國際動物源性食品貿(mào)易的必檢項目[3]。有關水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-紫外法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法((HPLC-MS/MS)[8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[9]等。UPLC-MS/MS法能夠充分發(fā)揮超高效液相色譜的高分離度、高分析速度與串聯(lián)質(zhì)譜的高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢，成為檢測水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物的最常使用的技術路線。本研究以國家標準GB/T 20752-2006[10](豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)中的實驗方法為基礎，對樣品前處理過程進行了優(yōu)化，樣品衍生后乙酸乙酯直接提取，確保在能達到低檢出限要求的同時，控制回收率在90%～110%以內(nèi)，RSD均小于10%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水產(chǎn)樣品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，購于杭州世紀聯(lián)華超市。試劑：呋喃它酮代謝物(AMOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，10 mg/瓶，純度≥99.2%；呋喃西林代謝物(SEM)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.5%；呋喃妥因代謝物(AHD)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.38%；呋喃唑酮代謝物(AOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，50 mg/瓶，純度≥98.2%；呋喃它酮代謝物的內(nèi)標物(D5-AMOZ)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃西林代謝物的內(nèi)標物(13C15N-SEM)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99%；呋喃妥因代謝物的內(nèi)標物(13C3-AHD)，WITEGA，100 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃唑酮代謝物的內(nèi)標物(D4-AOZ)，WITEGA，50 mg/瓶，純度≥99.80%；2-硝基苯甲醛(C7H5NO3)，含量≥99.0%；二甲基亞砜(C2H6OS)，含量≥99%；乙酸乙酯，德國Merck公司，含量≥99.8%，規(guī)格4 L；磷酸氫二鉀(K2HPO4)，含量≥98%；乙腈，德國Merck公司，含量99.9%，規(guī)格4 L。

1.2 儀器與設備 1290 Infinity高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司)；QTRAP 5500 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)超純水儀，美國Millipore公司；氮氣吹干儀；分析天平：感量0.1 mg；離心機：轉速4000 r/min以上。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱溫:35 ℃；進樣量:10 μL；流動相及流速見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM；霧化氣GS1：55.0 psi；輔助加熱氣GS2：55.0 psi；氣簾氣CUR：35.0 psi；輔助氣溫度TEM：600 ℃；噴霧電壓IS：5500 V；入口電壓EP：10.0 V；碰撞池電壓CXP：12.0 V；碰撞氣CAD：MEDIUM。4種硝基呋喃類代謝物及其內(nèi)標物質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

表2 質(zhì)譜條件Tab 2 Condition of mass spectrometry

* 為定量離子

1.3.3 標準溶液的配制 將呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)及其相對應的四種內(nèi)標物分別配制成濃度為1 mg/L的標樣待用。

1.3.4 樣品預處理 取樣2 g，加入10 μL，濃度為1 mg/L的內(nèi)標，20 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液，0.3 mL衍生劑，充分渦旋混勻后37 ℃恒溫振蕩水浴避光反應 16 h。衍生后加入5 mL磷酸氫二鉀，混勻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH約為7.4。加入5 mL乙酸乙酯，充分振蕩后離心提取上清液，重復操作兩次，合并上清液，氮氣吹干，加入定溶液1 mL復溶后過0.22 μm濾膜，上機待測即可。

2 結果與分析

2.1 標樣質(zhì)譜圖 根據(jù)GB/T 20752-2006標準中要求，呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)檢出限為0.5 μg/kg。因此，按照改進步驟中的質(zhì)量數(shù)，將配制好的標準溶液再次稀釋后分別適量加入空白樣的水產(chǎn)品中，使得四種硝基呋喃類代謝物標樣上機濃度為1 μg/L，經(jīng)過改進的實驗方法處理后，進樣分析(圖1～圖8)。

圖1 呋喃它酮代謝物(AMOZ)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig 1 The mass-spectrogram of AMOZ

圖2 呋喃它酮代謝物的內(nèi)標物(D5-AMOZ)出峰質(zhì)譜圖Fig 2 The mass-spectrogram of internal-standard for AMOZ

圖3 呋喃西林代謝物(SEM)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.3 The mass-spectrogram of SEM

圖5 呋喃妥因代謝物(AHD)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.5 The mass-spectrogram of AHD

圖6 呋喃妥因代謝物的內(nèi)標物(13C3-AHD)出峰質(zhì)譜圖Fig.6 The mass-spectrogram of internal-standard for AHD

圖7 呋喃唑酮代謝物(AOZ)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.7 The mass-spectrogram of AOZ

圖8 呋喃唑酮代謝物的內(nèi)標物(D4-AOZ)出峰質(zhì)譜Fig.8 The mass-spectrogram of internal-standard for AOZ

從圖1～圖8出峰質(zhì)譜圖來看，呋喃它酮出峰時間在2.06 min，峰高最大值4.0 e5cps，D5-AMOZ內(nèi)標出峰時間在2.02 min，峰高最大值3.1 e5cps；呋喃西林出峰時間在3.67 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C15N-SEM內(nèi)標出峰時間在3.66 min，峰高最大值1.9 e5cps；呋喃妥因出峰時間在3.87 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C3-AHD內(nèi)標出峰時間在3.86 min，峰高最大值2.85 e5cps；呋喃唑酮出峰時間在4.65 min，峰高最大值1.3 e6cps，D4-AOZ內(nèi)標出峰時間在4.60 min，峰高最大值2.1 e6cps。由此可見水產(chǎn)品中的基質(zhì)對硝基呋喃類代謝物的檢測并無干擾，出峰時間穩(wěn)定峰型較為明顯。

2.2 回收率試驗 取上述陰性樣品，分別加入標準溶液，使得四種硝基呋喃類代謝物理論上機濃度分別為1、5、10、15、20 μg/L，按照樣品預處理方法進行處理，上機進樣分析后，結果如表3，由此可見，經(jīng)過多次實驗表明，該改良版實驗步驟，能夠完全保證實驗數(shù)據(jù)的有效可行性，回收率控制在90%～120%之間。

表3 各目標物加標回收率Tab 3 The recovery rate of four nitrofuran metabolites

2.3 精密度試驗 取濃度為1 μg/L的基質(zhì)標準溶液,重復進樣3次，結果(表4)表明，四種硝基呋喃類代謝物3次相應的RSD值均<10%，精密度良好。

表4 檢測方法精密度Tab 4 Precision of inspection method

2.4 實際樣品測定 為驗證方法的可靠性，從超市購買了多種類水產(chǎn)品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，根據(jù)改進后的方法進行測定。多數(shù)陰性樣品各離子譜圖較為干凈，沒有檢出。其中一明蝦樣品檢出含有呋喃西林代謝物(SEM)，該樣品在對應時間出峰明顯(圖9)，多次重復檢測后判定其為陽性樣品。

3 討論與結論

在硝基呋喃類代謝物殘留檢測時，固相萃取方法在樣品前處理的凈化方面具有明顯效果，可同時完成樣品的提取與凈化，大大提高檢測靈敏度。華正罡[11]等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中硝基呋喃類藥物殘留，對陰離子交換混合機理柱(MAX)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)的凈化效果進行考察，實驗結果表明，在 pH 7.2～7.4時 HLB 固相萃取柱回收率最高。王娜[12]等在高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法檢測豬肉中四種硝基呋喃類代謝物中，衍生溶液用Oasis HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，流動相定容，使用 Oasis HLB柱所得四硝基呋喃代謝物各自的平均回收率均在96.3% 以上。但是固相萃取方法也存在操作繁瑣、費時較多、需要耗費大量的有機溶劑等缺點。GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定》[10]中采用Oasis HLB固相萃取柱凈化，Oasis HLB 需要提前用甲醇和水活化，同時一定要保證柱體濕潤。另外，固相萃取對畜肉、禽肉等動物組織具有較好的提取凈化效果，但對基質(zhì)比較復雜的水產(chǎn)樣品(魚、蝦、蟹和貝類)，樣品組織提取液呈黏稠、膠體狀，則易產(chǎn)生堵塞、不宜洗脫。因此，采用GB/T 20752-2006的方法處理樣品，效果并不好，因此，需要改進樣品的提取凈化方式。

圖9 陽性樣品SEM及其內(nèi)標出峰譜圖Fig 9 The mass-spectrogram of SEM and its internal-standard for of Positive Sample

劉四新[13]等研究液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物，對現(xiàn)行GB/T 20752-2006中的前處理中的樣品稱取量、水解和衍生化、凈化和定容試劑都進行了改進，其中在凈化環(huán)節(jié)采用乙酸乙酯液液萃取，改進后方法的回收率為81.3%～106.0%，相對標準偏差小于11%。吳亞梅[14]等就農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006(簡稱方法1)和GB/T 20752-2006(簡稱方法2)兩種檢測方法進行對比研究，結果發(fā)現(xiàn)方法1采用乙酸乙酯提取的前處理方法簡單，檢測信號干擾少，檢出限、精密度和回收率優(yōu)于方法 2，結果相對更準確可靠。在水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物檢測時，樣品經(jīng)酸水解后衍生化，采用乙酸乙酯直接提取，氮吹后用流動相溶解殘留物，然后上機檢測。該方法操作簡單，提取液易揮干(約20 min)，無需固相萃取特殊裝置，成本較低，并且通過二級質(zhì)譜的高選擇性，可以進一步排除雜質(zhì)的干擾，結果也比較穩(wěn)定。

在本文研究中，以國家標準GB/T 20752-2006的實驗方法為基礎，對樣品前處理過程進行了改進，樣品衍生后采用乙酸乙酯直接提取，操作步驟簡單方便。經(jīng)過多次試驗，證明改進后方法的結果及穩(wěn)定性可靠，四種代謝物回收率控制在90%～120%以內(nèi)，RSD<10%，能夠達到標準要求的目標物檢出限，可適用于日常水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的大批量樣品檢測工作。