靶向MUC1CAR-NK對小鼠胃癌模型的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究

朱貝 韓雙印 楊亞莉

【摘 要】目的：觀察由靶向黏蛋白1（Mucl protein 1，MUC1）嵌合抗原受體修飾的NK細(xì)胞（Chimeric antigen receptor-Natural killer cell，CAR-NK）對裸鼠胃癌模型腫瘤生長的影響。方法：首先，在48只裸鼠右肢腋下注入0.2ml濃度為105個/ml的人胃癌細(xì)胞（MGC-803）構(gòu)建胃癌腫瘤模型。當(dāng)小鼠腫瘤體積生長至約100mm3時，將小鼠隨機(jī)分為對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組和實(shí)驗(yàn)5組。其中，對照組給予未修飾的濃度為1×105個/ml 的NK細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)1-5組給予相同體積靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞，細(xì)胞濃度分別為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109/ml。給藥后，每隔3d統(tǒng)計腫瘤的長短徑以及小鼠體重。自接種MGC-803 26d后，脫頸處死小鼠，稱量小鼠腫瘤重量并計算其生長率。結(jié)果：與對照組比，各實(shí)驗(yàn)組瘤重明顯減輕，瘤體積明顯減少（P<0.05），但各實(shí)驗(yàn)組之間比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。與對照組比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的生長率明顯增加（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)1、2、3組顯著高于實(shí)驗(yàn)4、5組（P<0.05）。此外，各組小鼠的腫瘤體積均隨小鼠生長時間的延長呈逐漸增加趨勢。且從第8d給予CAR-NK細(xì)胞治療后，其余各實(shí)驗(yàn)組在相同給藥時間點(diǎn)與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論：裸鼠皮下移植腫瘤模型顯示，靶向MUC1的 CAR-NK細(xì)胞對表達(dá)MUC1的MGC-803細(xì)胞生長具有較好的抑制作用，且所用濃度范圍較廣，安全系數(shù)較高。

【關(guān)鍵詞】黏蛋白1;嵌合抗原受體NK細(xì)胞;胃癌;裸鼠模型

【中圖分類號】R573 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-597X（2019）19-0031-02

胃癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，由于前期癥狀不明顯，易與其他慢性病混淆，多數(shù)患者至疾病晚期才得到診斷[1-2]。手術(shù)、放療和化療是目前胃癌治療的主要方法，盡管能起到一定效果，但仍未明顯改善患者預(yù)后[3]?；谇逗峡乖荏w修飾T細(xì)胞或NK細(xì)胞是近年快速發(fā)展的免疫治療新技術(shù)，在血液腫瘤中已取得良好的抗腫瘤作用。然而，在實(shí)體瘤中仍面臨很大挑戰(zhàn)。MUC1是在多種腫瘤表面表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，靶向MUC1的各種免疫治療策略已在實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)中展開[4]。本研究制備靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞，觀察其對MGC-803裸鼠模型的抑瘤作用，為胃癌的細(xì)胞免疫治療探索新方法。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：6～8周齡，體重為20±2g的SPF級成年雄性BALB/c（nu）小鼠48只，均購自凱學(xué)生物科技（上海）有限公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人胃癌MGC-803和靶向MUCI的CAR-NK細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MGC-803培養(yǎng)：將人胃癌細(xì)胞株MGC-803常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS 洗滌3次，臺盼藍(lán)染色法檢測其細(xì)胞活力，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml。

1.2.2 靶向MUC1的 CAR-NK細(xì)胞培養(yǎng)：取出凍存細(xì)胞，置于37℃恒溫水浴中快速融化，于超凈工作臺內(nèi)將細(xì)胞懸液吸出置于15ml離心管中，加入10ml RPMI l640培養(yǎng)基1000rpm/min離心5min洗滌，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，置于含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的RPMI l640培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3 胃癌小鼠模型的建立

1.3.1 將6周齡BALB/c裸鼠先置于SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)3d后，稱量小鼠初始體重。

1.3.2 小鼠狀態(tài)適應(yīng)后將對數(shù)生長期的MGC-803制備成濃度為1×105/ml單細(xì)胞懸液，吸取0.2ml 接種于BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下[5]。

1.3.3 接種后每天觀察小鼠狀態(tài)以及成瘤狀況，約第5d可摸到右肢下結(jié)節(jié)，當(dāng)結(jié)節(jié)長徑大于5mm時，表示模型構(gòu)建成功。在腫瘤長到第8d時，用游標(biāo)卡尺測量小鼠右肢下結(jié)節(jié)的長短徑，并稱量每只小鼠體重。

1.4實(shí)驗(yàn)治療方法

當(dāng)小鼠腫瘤體積生長至約100mm3（約接種MGC-803的第8d）時，對照組尾靜脈給予0.2ml濃度為1×105/ml的正常NK細(xì)胞溶液;實(shí)驗(yàn)1-5組分別尾靜脈給予0.2ml濃度為1×105、1×106、1×107、1× 108、1×109 CAR-NK/ml的靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞，且每隔3d尾靜脈給藥一次，共給藥6次。同時每隔3d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（A）和垂直橫徑（B），按公式V=A×B2/2計算腫瘤體積，繪制腫瘤體積增長曲線，同時稱量小鼠體重并繪制體重生長曲線。免疫治療結(jié)束后第3d，對小鼠的體重、瘤重以及剝瘤后體重進(jìn)行稱量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和One-Way ANOVA方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1免疫治療對小鼠行為學(xué)等特征的影響

模型建立前每只小鼠行為表現(xiàn)相似，正常飲水和進(jìn)食。但自移植瘤模型成功建立后，對照組小鼠開始表現(xiàn)出活動量減少，精神狀態(tài)差和食欲下降的癥狀，且在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第16d時基本不進(jìn)食;而接受CAR-NK細(xì)胞免疫注射治療后的各實(shí)驗(yàn)組小鼠，精神狀態(tài)都較對照組活潑，且食欲下降不太明顯。

2.2 免疫治療對各組小鼠瘤重和瘤體積的影響

與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組瘤重明顯減輕，瘤體積顯著減少，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）;但各實(shí)驗(yàn)組之間相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），詳見表1。

2.3 免疫治療對各組小鼠生長率的影響

與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠生長率明顯增高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）;且實(shí)驗(yàn)1、2、3組小鼠的生長率顯著高于實(shí)驗(yàn)4和5組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），詳見表2。

2.4 免疫治療對小鼠腫瘤體積的影響

結(jié)果顯示，各組小鼠的腫瘤體積均隨小鼠生長時間的延長呈逐漸增加趨勢（圖1）。其中，對照組小鼠的腫瘤體積隨生長時間持續(xù)增加，且增長速度較快;而各實(shí)驗(yàn)組則隨小鼠的生長時間表現(xiàn)為較平緩增長。此外，從第8d給予CAR-NK細(xì)胞治療后，其余各實(shí)驗(yàn)組在相同給藥時間點(diǎn)與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），詳見圖1。

2.5 免疫治療對各組小鼠體重的影響

在第8d給藥后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組小鼠體重出現(xiàn)短期快速增長，之后增長平緩;實(shí)驗(yàn)4、5組小鼠體重一直保持較慢增長，且在第23d后體重出現(xiàn)輕微的下降;而對照組小鼠體重表現(xiàn)出持續(xù)下降趨勢，且隨時間延長下降速度逐漸增快，詳見圖2。

3.討論?

MUC是一類高分子量糖蛋白，主要特征為含有一個高度糖基化的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，是目前研究較為深入的黏蛋白，屬跨膜蛋白[6-7]。人MUC1基因定位于1q21.24 位點(diǎn)上，MUC1 蛋白由多肽骨架和O-糖苷鍵鏈接的糖基側(cè)鏈組成，多肽骨架由胞內(nèi)段、跨膜段、胞外段三個部分構(gòu)成。其中胞內(nèi)段可介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且胞內(nèi)段和跨膜段在不同種屬之間的結(jié)構(gòu)高度保守;胞外段決定MUC1 空間結(jié)構(gòu)特異性和免疫原性[8-9]。通常情況下，由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的MUC1 可在黏膜表面形成膠樣凝膠，發(fā)揮潤滑、保護(hù)黏膜以及屏障作用。當(dāng)細(xì)胞癌變時，MUC1結(jié)構(gòu)與功能也隨之變化，直接參與腸癌、膀胱癌等的發(fā)生發(fā)展[10-11]。MUC1在癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加，呈非極性，同時MUC1糖鏈的糖基化異常，糖鏈變短且分支減少，可引起新糖鏈表位形成及肽鏈表位暴露，使MUC1成為能被免疫系統(tǒng)識別的腫瘤抗原。有學(xué)者認(rèn)為MUC1作為一種腫瘤免疫抗原，在對其進(jìn)行靶向效應(yīng)時，或可對腫瘤的進(jìn)展產(chǎn)生一定影響。

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程。隨著人們對腫瘤研究的不斷深入，MUC1在胃癌表達(dá)和轉(zhuǎn)移中的作用也日益凸顯[12]。有研究表明，MUC1粘蛋白的表達(dá)增加與胃癌的預(yù)后較差顯著相關(guān)[13]。Grohmann等[14]對128例胃癌標(biāo)本的研究顯示，MUC1在管狀腺癌中的表達(dá)比印戒細(xì)胞癌、硬癌或未分化癌中強(qiáng);在腸型胃癌中的表達(dá)比在彌漫性胃癌中強(qiáng)，且在I期患者中的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此，可通過檢測MUCl的表達(dá)來確定胃癌的惡性程度及預(yù)后判定。綜上所述，本文主要針對MUC1免疫抗原構(gòu)建靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞對胃癌腫瘤模型進(jìn)行免疫治療。

本研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組瘤重明顯減輕，瘤體積明顯減少說明靶向MUC1的 CAR-NK細(xì)胞有抑制腫瘤增長的作用;與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的生長率明顯增加，且實(shí)驗(yàn)1、2、3組的生長率顯著高于實(shí)驗(yàn)4、5組，提示1、2、3組靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞濃度抑制胃瘤小鼠效果較為理想。國內(nèi)外已有研究報道，采用MUC1-2 VNTR基因治療后可明顯減小腫瘤體積及質(zhì)量[15-16]，與本研究結(jié)果相一致。此外，本研究顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的瘤體積隨小鼠生長時間延長而緩慢增加，而對照組小鼠的瘤體積隨小鼠生長時間延長呈快速增長趨勢。但在小鼠體重方面，第8d給藥后，實(shí)驗(yàn)1、2、3組小鼠體重出現(xiàn)了短期快速增長，之后增長平緩;實(shí)驗(yàn)4、5組小鼠體重一直保持較慢增長直至23d后出現(xiàn)輕微的體重下滑;而對照組小鼠體重表現(xiàn)出持續(xù)下滑的趨勢，提示1×105、1×106、1×107 CAR-NK/ml濃度的靶向 MUC1 的CAR-NK細(xì)胞對小鼠體重影響較大。從上可知，靶向MUC1的CAR-NK細(xì)胞對小鼠胃癌腫瘤模型具有較好的治療作用。

綜上所述，靶向MUCI的CAR-NK細(xì)胞對于表達(dá)MUC1的MGC-803所形成的實(shí)體瘤生長具有較好的抑制效果，且所用濃度范圍較廣，安全系數(shù)較高，可減輕疾病所帶來的痛楚，為后續(xù)深入研究抑制胃癌腫瘤的作用機(jī)理奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

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作者簡介：朱貝（1989—），女，漢，河南新鄉(xiāng)人;單位：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，碩士研究生，研究方向：腫瘤免疫治療的臨床和基礎(chǔ)研究.

通訊作者：韓雙印;單位：河南省人民醫(yī)院;博士研究生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤免疫治療的臨床和基礎(chǔ)研究.