桿狀病毒在癌癥基因治療方面的應(yīng)用

駱超超　楊婧如　張妍　陳琛　劉蕓菲　王奕　曹錦濤　陳瑤

【摘? 要】隨著癌癥發(fā)病率居高不下，人們一直在追求如何能夠高效的治療癌癥。隨著醫(yī)藥科學(xué)的飛速發(fā)展，利用基因治療技術(shù)來治療癌癥有了顯著成效?；蜉d體的選擇是基因治療的核心技術(shù)之一，桿狀病毒一直就是備受關(guān)注的一類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。經(jīng)過研究者們的深入研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒在肝癌、胃癌、黑色素瘤及腦腫瘤等的基因治療中具有較強(qiáng)的可行性。目前還可以進(jìn)一步解決桿狀病毒引起的體內(nèi)補(bǔ)體反應(yīng)，同時也能不斷提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率。本文將著重介紹桿狀病毒在癌癥基因治療中的應(yīng)用。

【中圖分類號】R730.5????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）03-0073-01

1 桿狀病毒

1.1桿狀病毒

桿狀病毒是節(jié)肢動物的病源病毒，具有囊膜的雙鏈環(huán)狀DNA，且其基因組為單一的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，并以超螺旋形式壓縮包裝。根據(jù)包涵體的形態(tài)及其理化性質(zhì)，桿狀病毒科被分為核型多角體病毒屬（nuclear polyhedrosis virus）、顆粒體病毒屬（Granulosis Virus， GV）。核型多角體病毒多用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的運(yùn)用。與其他病毒不同的是，在其雙向復(fù)制的周期中，桿狀病毒以兩種形態(tài)存在：一種是包涵體病毒（occluded virus， OV），是昆蟲間水平感染的病毒形式;一種是細(xì)胞外芽生病毒（budded virus， BV），是個體內(nèi)細(xì)胞間感染的病毒形式。雖然它們的遺傳組成相同，但有著不同的形態(tài)、囊膜結(jié)構(gòu)、組成和功能。在時序性的基因表達(dá)過程中，在極晚期基因表達(dá)的時候，會有兩種高效表達(dá)的非必需蛋白產(chǎn)生，即多角體蛋白和P10蛋白。正因如此，桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)理想的外源基因插入點(diǎn)是這兩個基因位點(diǎn)。

1.2桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒載體系統(tǒng)主要分為兩大類：一類是用于表達(dá)單個外源基因的載體;另一類是多元表達(dá)載體，用于插入并表達(dá)兩個或多個外源基因[1]。一種由研究者開發(fā)的通過利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子原理的Bac-Bac表達(dá)系統(tǒng)重組率幾乎為100%，且重組時間迅速^[2]。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要應(yīng)用3個方面：一是應(yīng)用于生物殺蟲劑，二是應(yīng)用于生物分子的研究;三是應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究之中，可用于生產(chǎn)疫苗和進(jìn)行基因治療。

2 癌癥基因治療

2.1 癌癥基因治療的介紹

癌癥的基因治療就是根據(jù)不同癌癥的發(fā)病機(jī)制，利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過合適的載體把特異性的外源目的基因片段導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中并使其表達(dá)，以糾正原有細(xì)胞錯誤或補(bǔ)償缺陷的基因，從而起到對腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用，達(dá)到治療癌癥的目的^[3]。

2.2 癌癥基因治療的研究

目前的臨床研究集中于刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)和直接殺傷腫瘤兩個方面： 前者增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)是通過轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子或共刺激因子基因;后者則是通過轉(zhuǎn)移腫瘤殺傷基因。癌癥治療所用的治療主要有三類：分子化療、基因免疫、突變補(bǔ)償。分子化療是通過轉(zhuǎn)移所謂“自殺基因”而殺滅腫瘤細(xì)胞;基因免疫是通過轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子或共刺激因子基因刺激抗腫瘤免疫;突變補(bǔ)償是抑制異常的癌基因或誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)^[4]。

3 桿狀病毒在癌癥基因治療方面的應(yīng)用

3.1 體內(nèi)基因治療

桿狀病毒是基因治療載體的一種，許多傳統(tǒng)治療方法難以治療的癌癥因為癌癥基因治療方法有了新的可能性。研究員在發(fā)現(xiàn)桿狀病毒介導(dǎo)的癌癥基因治療的可行性后，就在哺乳動物模型中測試了肝癌、胃癌、黑色素瘤及腦 腫瘤等的治療效果^[5]。例如，Huang及其同事研究發(fā)現(xiàn)桿狀病毒載體介導(dǎo)的正常上皮細(xì)胞特異性-1基因轉(zhuǎn)染可抑制胃癌生長，且證實了該基因治療對移植瘤裸鼠GC的治療作用^[6]。王樂瑤構(gòu)建了攜帶OriP和Rta基因表達(dá)框的重組桿狀病毒BV-RO，發(fā)現(xiàn)BV-RO只能有效抑制EBV相關(guān)腫瘤增殖，不會抑制皰疹病毒科γ亞科的Epstein-Barr病毒（EBV）陰性細(xì)胞^[7]。

要繞過與哺乳動物病毒載體相關(guān)的一些固有問題需要構(gòu)建新的桿狀病毒載體能，并為癌癥基因治療提供額外的選擇^[8]。對于那些對單一療法有抵抗力的癌癥，可以采用聯(lián)合治療。Guo及其同事測試了一種結(jié)合桿狀病毒介導(dǎo)的p53腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)移和使用組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c的策略，測試過程發(fā)現(xiàn)了一種新的治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的方法——使用桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移結(jié)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑^[9]。

3.2 離體基因治療

離體基因治療是桿狀病毒應(yīng)用之一，它是指從體內(nèi)分離出適當(dāng)?shù)募?xì)胞后，在實驗室環(huán)境用桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增，再移植回體內(nèi)的過程。Suzuki及其同事在小鼠模型中用離體方法測試表明，桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓來源的樹突細(xì)胞（BMDCs），在該模型中可有效抑制肺癌，并且不會引起肝腎功能的損害^[10]。Yin及其同事研究發(fā)現(xiàn)感染Bac-GFP的SW1116細(xì)胞的存活率顯著高于Bac-NIS，表明腫瘤細(xì)胞可以被NIS基因介導(dǎo)的131I攝取特異性殺死，證明桿狀病毒載體介導(dǎo)的NIS基因治療是一種治療結(jié)腸癌的潛在方法^[11]。

4 桿狀病毒在癌癥基因治療中的應(yīng)用的優(yōu)勢與劣勢

4.1桿狀病毒在癌癥基因治療中的應(yīng)用的優(yōu)勢

桿狀病毒作為癌癥基因治療的載體具有的特征符合理想載體的要求。桿狀病毒對導(dǎo)入的哺乳動物細(xì)胞沒有傷害和威脅，安全性高。在哺乳動物細(xì)胞中，桿狀病毒基因的啟動子沉默，基因表達(dá)沉默，對轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞不會產(chǎn)生影響^[12]。桿狀病毒基因容量大，呈棒狀，可延伸，可容納較大的病毒DNA基因組。目前在一個桿狀病毒基因組中最多的可以插入5個外源基因，充分保證了足量性。在病毒基因組中，缺失非必需基因?qū)Σ《倔w復(fù)制無影響，所以非必需基因可給插入外源性基因提供了位點(diǎn)^[13]。桿狀病毒中的多角體蛋白基因就是一個非必需基因，即桿狀病毒具有可導(dǎo)入性。另外，引入了可在哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的啟動子（如巨細(xì)胞病毒的IEl啟動子）的桿狀病毒可以在哺乳動物細(xì)胞中持續(xù)性表達(dá)。Nasimuzzaman， M.及其同事研究出了一種簡單的生產(chǎn)及純化桿狀病毒的方法，可擴(kuò)大其規(guī)模，生產(chǎn)出用于基因治療應(yīng)用的臨床級載體^[14]。癌癥基因治療突破了傳統(tǒng)療法轉(zhuǎn)移方面的局限，加強(qiáng)了載體的特異性，盡量減少副作用，是一種有效、安全的治療方式。

4.2桿狀病毒在癌癥基因治療中的應(yīng)用的劣勢

在注射組織內(nèi)，桿狀病毒不會進(jìn)行擴(kuò)散。Heikura等通過實驗發(fā)現(xiàn)在缺血性兔的骨骼肌模式中，桿狀病毒來表達(dá)?-galactosidase and VEGF-DΔNΔC時，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞只在針道附近存在^[15]。桿狀病毒傳遞的基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)時間短。選擇合適的啟動子， 采取多次感染，不斷的補(bǔ)充新的基因可以解決。桿狀病毒還可能會被補(bǔ)體或免疫系統(tǒng)迅速滅活。就目前而言，避免被滅活的方法有：使用具有抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的動物模型;注入前應(yīng)用補(bǔ)體激活因子^[15];病毒包膜上表達(dá)補(bǔ)體干擾因子^[16];在免疫特權(quán)點(diǎn)進(jìn)行基因傳遞（如眼睛、大腦、 睪丸或中樞神經(jīng)系統(tǒng)。 ）^[17];使用BmNPV，在體內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)中BmNPV對補(bǔ)體失活的抵抗力更強(qiáng)^[18];體外基因傳遞，從體內(nèi)分離出合適細(xì)胞，進(jìn)行桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，質(zhì)量控制后，移植回機(jī)體。

腫瘤的基因治療仍處于探索階段，且對癌癥分子機(jī)制有許多不了解。目前，桿狀病毒的基因治療在治療胃癌方面剛剛起步，在臨床動物研究中沒有在癌癥治療中的實際應(yīng)用。

5 前景與展望

如今在癌癥的基因治療中，研究者在其抑制癌細(xì)胞再轉(zhuǎn)移方面克服了傳統(tǒng)療法的局限性，基因治療能通過最大限度地加強(qiáng)病毒載體對腫瘤細(xì)胞的特異性，以及盡可能地減少對正常細(xì)胞的副作用，將達(dá)到比傳統(tǒng)療法更有效的治療效果。桿狀病毒作為一種非復(fù)制型基因治療載體，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。隨著對其靶向性、調(diào)控性、安全性的深入研究和進(jìn)一步解決其引起的體內(nèi)補(bǔ)體反應(yīng)及不斷提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)效率，桿狀病毒必將廣泛的應(yīng)用于哺乳動物的基因治療。

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