木通愈傷誘導(dǎo)及腋芽萌發(fā)研究

李 祥 江云兵 李同建 文 鋒 方荷芳 賈明良

（九江學(xué)院，江西九江 332000）

木通［Akebia quinata（Houtt.）Decne.］為通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）的一種落葉或半常綠木質(zhì)藤本植物，通常有小葉5片，因而常被稱為五葉木通［1］。木通具有較高的藥用價值，味微苦，性平，具有舒肝和胃，活血止痛，軟堅散結(jié)，抗炎、利尿、抑菌等功效［2，3］，其中的活性物質(zhì)包括三萜皂苷類成分、甾醇、齊墩果酸等［4-7］。葉片姿態(tài)優(yōu)美，既可觀花又可賞果，且果實可以食用，是一種觀賞價值非常高的垂直綠化材料及新型水果資源［8、9］。

除藥用和綠化外，當(dāng)前對于木通的研究利用還包括核型分析、栽培技術(shù)等方面［10-11］。同屬的三葉木通已有了很多組織培養(yǎng)的報道［12-16］，而對于木通的組織培養(yǎng)研究尚未見報道，因此有必要對其組織培養(yǎng)進行研究，為進一步的進行優(yōu)質(zhì)資源的開發(fā)和品系改良奠定基礎(chǔ)。為此，筆者利用木通的幼嫩枝條作為外植體，對其愈傷誘導(dǎo)、褐化抑制以及腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)等過程進行了初步研究，為進一步完善木通組織培養(yǎng)體系，并進行品系改良和遺傳轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料本實驗所選取材料來自九江學(xué)院木通種質(zhì)資源圃，以優(yōu)良品系木通幼嫩莖段為外植體。取材時間為春季的3—5月份木通抽條生長的旺盛時期，盡量保證實驗材料的狀態(tài)一致。選擇晴朗天氣取材，然后將材料置于采樣袋內(nèi)，噴水保濕后帶回實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 獲取無菌外植體 采用木通幼嫩的莖段為外植體，流水沖洗后在超凈工作臺中用75%酒精消毒1min，無菌水沖洗3次，再利用0.1%的氯化汞水溶液（升汞）進行滅菌處理，處理時間梯度設(shè)置為1、3、5、10、15min，隨后無菌水沖洗5次以洗凈升汞殘留，置于無菌瓶中待用。將滅菌后的幼嫩莖段切割為0.5cm左右長度，平放接種入培養(yǎng)基（MS+2，4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L），每瓶5個外植體，于培養(yǎng)室（25±2）℃、見光條件（光周期12h/d）下培養(yǎng)觀察，15d后記錄污染率、褐化率等生長情況。

1.2.2 誘導(dǎo)莖段愈傷組織 將滅菌后的幼嫩莖段切割為0.5cm左右長度，接種至不含激素的MS培養(yǎng)基以及添加不同濃度的2，4-D（設(shè)定濃度為1.0、2.0、5.0mg/L）和6-BA（設(shè)定濃度為0.1、0.5、1.0mg/L）的MS培養(yǎng)基中，每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)20d后，記錄出愈時間（d）、愈傷組織誘導(dǎo)率（%）、褐化率（%）及愈傷生長情況。培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照強度1500～2000lx，光照周期12h/d。

1.2.3 愈傷褐化抑制 以木通幼嫩莖段為外植體，利用1.2.1中篩選出的優(yōu)化滅菌組合滅菌后接種至1.2.2中得到的合適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上?？疾旃腆w培養(yǎng)、液體培養(yǎng)2種培養(yǎng)方式，不同濃度活性炭，見光、避光2種培養(yǎng)條件等因素對于褐化的影響，以期望得到合適的褐化抑制方法。設(shè)置固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)2種培養(yǎng)方式，固體培養(yǎng)添加瓊脂6.0g/L，液體則不添加瓊脂。培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭（AC），AC濃度梯度設(shè)定為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0g/L，接種好后置于見光及避光2種條件下培養(yǎng)。每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)20d后，記錄愈傷組織誘導(dǎo)率（%）、褐化率（%）等數(shù)據(jù)。培養(yǎng)條件為：見光培養(yǎng)時，光照強度1500～2000lx，光照時間12h/d，溫度（25±1）℃；避光培養(yǎng)除遮蔽光照外其余同見光培養(yǎng)。

1.2.4 篩選腋芽無菌萌發(fā)條件 以木通幼嫩帶芽莖段為外植體，以1.2.1中篩選出的滅菌組合滅菌后接種至含有不同激素配比的MS培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)，考查不同激素配比對腋芽萌發(fā)的影響。具體激素配比為：培養(yǎng)基A：6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；培養(yǎng)基B：NAA 0.5mg/L；培養(yǎng)基C：IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；培養(yǎng)基D：GA32.0mg/L。每瓶接種5個外植體，每個處理接種6瓶，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d后，記錄愈傷組織誘導(dǎo)率（%）、褐化率（%）、死亡率（%）、出芽率（%）等情況。培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照強度1500～2000lx，光照周期12h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌條件對無菌外植體獲得的影響對幼嫩莖段滅菌處理后接種培養(yǎng)，污染和褐化情況如表1所示。從表1可以看出，升汞滅菌1min和3min，污染率為100%，均不能達到較好的滅菌效果。隨著升汞滅菌時間的延長，污染率逐漸降低，而褐化率則由于升汞的毒害而逐漸升高，差異顯著。綜合考慮污染和褐化的情況，木通幼嫩莖段合適的滅菌處理組合為75%乙醇消毒1min，后升汞滅菌10min，并用無菌水沖洗干凈后接種，此時雖然污染率不是最低，但是褐化情況較低，為合適的滅菌組合。

表1 滅菌條件對無菌外植體獲取的影響

2.2 不同激素配比對莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響不同激素配比下莖段愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表2所示。從表2可以看出，在不添加任何激素的YS1培養(yǎng)基中無愈傷組織產(chǎn)生。有生長激素的MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)出愈傷組織，出愈時間無明顯差別，集中在5～7d。愈傷誘導(dǎo)率方面，YS8、YS4中的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為85%和81%，高于其他培養(yǎng)基，差異顯著。從褐化情況考察來看，褐化率最低的為YS5為11.67%，其次為YS3、YS4、YS7、YS8、YS9，相互之間無顯著差異。其中YS4和YS8愈傷組織生長情況良好多為致密型黃白色愈傷組織，其余多為松散型白色愈傷組織。綜合考慮愈傷誘導(dǎo)率、褐化情況以及愈傷組織的狀態(tài)，木通幼嫩莖段的愈傷組織誘導(dǎo)合適培養(yǎng)基為YS8培養(yǎng)基，即為MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，pH5.8。

表2 不同激素配比對莖段愈傷誘導(dǎo)的影響

2.3 不同抑制方式對愈傷誘導(dǎo)時褐化的影響以幼嫩莖段為外植體，考察固體、液體培養(yǎng)方式；見光、避光2種培養(yǎng)條件；以及不同濃度活性炭對褐化的影響，結(jié)果見表3。由表3可知：固體培養(yǎng)條件下，不論見光還是避光培養(yǎng)時，隨著活性炭濃度的提高，愈傷誘導(dǎo)率呈現(xiàn)下降趨勢，而避光條件下愈傷的誘導(dǎo)率優(yōu)于見光培養(yǎng)的?？傮w而言，以避光培養(yǎng)，活性炭濃度為0.1g/L時愈傷誘導(dǎo)率最高，為86.33%，差異顯著。以褐化率為標(biāo)準(zhǔn)，見光培養(yǎng)時，活性炭（AC）濃度為0.1g/L時最低，為5%，差異顯著。而避光培養(yǎng)時則在活性炭（AC）濃度在5.0g/L時最低，為4.67%，其次為活性炭（AC）濃度在0.1g/L時的5%，兩者并無顯著差異。液體培養(yǎng)時，不論何種光照及活性炭（AC）濃度，外植體均逐漸死亡，無愈傷組織產(chǎn)生，可見液體培養(yǎng)不適于木通莖段誘導(dǎo)愈傷。綜合考慮，結(jié)合2.1和2.2的結(jié)果，較好的木通幼嫩莖段愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為：接種至MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+AC 0.1g/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L的培養(yǎng)基中進行避光培養(yǎng)。

表3 不同培養(yǎng)條件對愈傷誘導(dǎo)及褐化的影響

2.4 不同激素配比對腋芽萌發(fā)和莖段生長的影響以木通幼嫩帶芽莖段為外植體，滅菌后接種至含有不同激素配比的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織及芽，考查不同激素配比對腋芽萌發(fā)和莖段生長的影響，結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，4種培養(yǎng)基均有腋芽萌發(fā)，但萌發(fā)率都較低，其中較高的是C培養(yǎng)基，為19.67%。愈傷組織誘導(dǎo)方面，C培養(yǎng)基條件下最低為5%，但C和D培養(yǎng)基的死亡率較高。綜合考慮，4種培養(yǎng)基比較來看，木通腋芽無菌萌發(fā)可利用C培養(yǎng)基，即MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0，2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，進行誘導(dǎo)。

表4 不同激素條件下腋芽萌發(fā)及生長狀況

3 結(jié)論與討論

本研究考察了滅菌條件對后續(xù)培養(yǎng)的影響，得到幼嫩莖段合適的滅菌處理組合為75%乙醇消毒1min，升汞滅菌10min，無菌水沖洗干凈。對不同激素條件下愈傷誘導(dǎo)的研究表明，莖段愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 5.0mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L?？梢姡线m的2，4-D濃度有利于愈傷的誘導(dǎo)，這與沈國林的研究結(jié)果一致［12］。

一般而言，避光培養(yǎng)以及活性炭的添加可在一定程度降低褐化的發(fā)生幾率［17］，這一結(jié)論在本實驗中也得到了驗證，木通愈傷誘導(dǎo)時合適的活性炭添加濃度為0.1g/L。更高濃度的活性炭添加后則會抑制愈傷組織的產(chǎn)生，分析可能是由于高濃度活性炭的無差別吸附導(dǎo)致的負面影響［18］。褐化抑制的常用方式還有液體培養(yǎng)方式，但本實驗接種至液體培養(yǎng)基中的所有外植體均死亡，這與張小紅等［19］、唐利球等［20］的研究結(jié)果又不相同，分析原因可能是不同種類植物基因型差異所致的。

本研究雖通過腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)得到了芽，但總體而言，腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)率較低，分析原因可能是由于莖段較幼嫩，腋芽發(fā)育不足以及培養(yǎng)條件不合適導(dǎo)致的［21-23］。后續(xù)可進一步進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，如選擇合適生長階段的腋芽以及合適的激素配比條件等。