補(bǔ)腎中藥對(duì)老化間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境改變及其分化方向調(diào)控的影響

劉幸明， 趙永杰， 蔡俊笙， 王翰宇， 梁志強(qiáng)， 程志安*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405；2.河南省許昌市立醫(yī)院，河南許昌461000；3.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

老化可使機(jī)體整體內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大改變，也使骨髓內(nèi)微環(huán)境與復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)調(diào)控發(fā)生改變。衰老大鼠的氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性骨丟失的重要致病機(jī)制［1］，老化使間充質(zhì)干細(xì)胞更趨向于分化為脂肪細(xì)胞，而不是成骨細(xì)胞，骨量持續(xù)性減少和丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生［2］。既往研究［3-4］表明，補(bǔ)腎中藥能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、提高抗氧化能力抑制成脂分化，但它能否通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境起到同樣的作用尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)為此進(jìn)行了研究。

1 材料

金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸來(lái)源于廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部（金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1 比例組成，健骨二仙丸由龜板、鹿角膠、黨參、枸杞子、續(xù)斷、山藥按1 ∶1 ∶3 ∶6 ∶6 ∶6 比例組成；六味地黃丸由熟地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 比例組成）。清潔級(jí)健康SD 成年大鼠40 只，體質(zhì)量（200±50） g，63～70 d，雌雄各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵） 2013-0002。胎牛血清（貨號(hào)SH30087.01）、DMEM-F12 培養(yǎng)基（貨 號(hào) SH30023.01B）、 DMEM-高 糖 培 養(yǎng) 基 （貨 號(hào)SH30022.01B）、青鏈霉素（貨號(hào)SH30010）、磷酸鉀緩沖液（貨號(hào)SH30256.01B） （美國(guó)Hyclone 公司）；cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（貨號(hào)G3582，美國(guó)Promega公司）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（StemPro?Adipogenesis Differentiation Kit， 美 國(guó)Gibco 公 司， 貨 號(hào)A10070-01）。潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)SW-CJ-IFD）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)SC3614）；倒置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)CKX41、U-CTR30-2，日本Olympus 公司）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司，型號(hào)HERAcell150i）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司，型號(hào)DMI6000B）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸濃煎后，分別按照89.1、75.9、85.8 g／kg 劑量灌胃給藥，每天2 次，連續(xù)7 d，最后1 d 灌胃給藥后2 h 再次給藥。第2 次給藥后1 h，大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清，除菌，滅活，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)前期實(shí)驗(yàn)篩選出的10%含藥血清［3］，將其隨機(jī)分為空白組、模型組、健骨二仙丸組、六味地黃丸組、金匱腎氣丸組。

2.2 模型建立［5］及鑒定 10 只大鼠沖出骨髓細(xì)胞培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，培養(yǎng)7 d，300 μmol／L H2O2處理24 h。然后，通過(guò)β-半乳糖苷酶染色鑒定，方法為固定15 min，洗滌，染色12 h，顯微鏡下觀察。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTS 法。收集0、48 h 細(xì)胞，加入cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑4 h 后酶標(biāo)儀讀板，讀取490 nm 波長(zhǎng)處OD 值，計(jì)算增殖率，公式為增殖率＝ （48 h 平均OD 值／0 h 平均OD 值-1） ×100% （同一樣品）。

2.4 成骨誘導(dǎo)、茜素紅染色及ALP 活性檢測(cè) 當(dāng)各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)3 d 后再維持7 d，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)ALP 活性，具體檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。繼續(xù)培養(yǎng)至14 d 后，茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。

2.5 成脂誘導(dǎo)及油紅O 染色 成脂誘導(dǎo)方法同“2.4” 項(xiàng)下成骨誘導(dǎo)。培養(yǎng)7 d 后，油紅O 染色鑒定脂肪細(xì)胞。

2.6 相關(guān)因子檢測(cè) 經(jīng)典TRIzol 提取總RNA，檢測(cè)濃度、提純、逆轉(zhuǎn)錄，rRT-qPCR 采用一步法，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，2-△△Ct法分析各基因表達(dá)差異。然后，應(yīng)用Invitrogen在線引物設(shè)計(jì)軟件OligoPer-fectTM Designer 設(shè)計(jì)， 采用BLAST 進(jìn)行比對(duì)，探針序列由美國(guó)Invitrogen 公司合成，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)（CollagenΙ ID 100199754，Runx2 ID 12393，DLX5 ID 13395，OSX ID 170574，OCN ID 632，PPARγ2 ID 19016，C／EBPβ ID 12608，TAZ ID 66826），引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 TAZ 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。裂解→收集→調(diào)整濃度→煮沸→冷卻→電泳→轉(zhuǎn)膜→TAZ 一抗→37 ℃孵育2 h→洗膜→二抗→洗膜→轉(zhuǎn)膜→顯影。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 氧化模型及成骨、成脂效果鑒定 氧化后老化間充質(zhì)干細(xì)胞在β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率明顯增加，細(xì)胞核周圍有天藍(lán)色顆粒，補(bǔ)腎中藥處理后陽(yáng)性率明顯減少，H2O2處理后老化間充質(zhì)干細(xì)胞增殖減少，而藥物處理后增加。表2、圖1 顯示，與空白組比較，模型組扁平狀、分布稀疏的老年細(xì)胞數(shù)量明顯增加；與模型組比較，成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞均被油紅O 染為紅色，各補(bǔ)腎中藥組紅染減少，而成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞均被茜素紅染為棕褐色，各補(bǔ)腎中藥組染色增加；模型組ALP 活性顯著低于空白組（P＜0.05），各補(bǔ)腎中藥組顯著高于模型組（P＜0.05）。

表2 各組對(duì)H2O2 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的影響

表2 各組對(duì)H2O2 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的影響

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 細(xì)胞藥物敏感性增殖率／% ALP 活性空白組 10.38±0.82 1.98±0.02模型組 -42.22±0.84* 0.29±0.01*金匱腎氣丸組 22.54±0.85△ 0.69±0.14△健骨二仙丸組 23.75±0.36△ 0.87±0.22△六味地黃丸組 19.72±1.24△ 0.60±0.16△

圖1 各組細(xì)胞顯微鏡圖（×100）

3.2 成骨、成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá) 表3 ～4 顯示，與空白 組 比 較， 模 型 組OCN、 Collagen Ⅰ、 DXL5、 OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達(dá)顯著下調(diào) （P ＜0.05），PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，各補(bǔ)腎中藥組OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3.3 TAZ 蛋白表達(dá) 圖2 顯示，與空白組比較，模型組TAZ 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，各補(bǔ)腎中藥組其蛋白表達(dá)有所上調(diào)，其中金匱腎氣丸組、六味地黃丸組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組成骨誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

表3 各組成骨誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 CollagenΙ Runx2 DLX5 OSX OCN空白組 1.00±0.21 1.00±0.08 1.00±0.10 1.00±0.06 1.00±0.17模型組 0.27±0.01* 0.13±0.01* 0.40±0.03* 0.22±0.02* 0.36±0.04*金匱腎氣丸組 0.30±0.04 0.32±0.03△ 0.90±0.02△ 0.79±0.11△ 0.53±0.05△健骨二仙丸組 0.45±0.05 0.43±0.01△ 0.52±0.11 0.55±0.01△ 0.76±0.09△六味地黃丸組 0.36±0.04 0.66±0.18△ 0.64±0.04△ 0.79±0.12△ 0.81±0.19△

表4 各組成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

表4 各組成脂誘導(dǎo)因子mRNA 表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 PPARγ2 C／EBPβ TAZ空白組 1.00±0.06 1.00±0.09 1.00±0.30模型組 4.28±0.27* 6.39±0.56* 0.21±0.04*金匱腎氣丸組 2.60±0.32△ 4.12±0.08△ 0.68±0.08△健骨二仙丸組 3.48±0.78△ 3.96±0.91△ 0.68±0.04△六味地黃丸組 2.96±0.50△ 3.09±0.54△ 0.87±0.05△

圖2 各組TAZ 蛋白表達(dá)

4 討論

機(jī)體衰老時(shí)，內(nèi)環(huán)境氧化應(yīng)激水平增高，抗氧化能力降低，導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，骨皮質(zhì)變薄，骨髓脂肪組織增多，具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞特性、增殖活性、端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度、分化能力與方向隨之改變，一方面涉及老化所致的細(xì)胞自身內(nèi)在因素改變，另一方面涉及細(xì)胞外骨髓內(nèi)微環(huán)境的改變。從細(xì)胞自身來(lái)說(shuō)，Runx2 為特異性成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而OSX、Runx2 是多條信號(hào)通路的共同下游基因，可作為其下游基因啟動(dòng)成骨基因［6-8］；TAZ 作為共同激活因子，可刺激Runx2 轉(zhuǎn)錄而抑制PPARγ2 轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，老化使其水平下調(diào)，干細(xì)胞更趨向與脂肪分化；ALP 活性正向反映成骨細(xì)胞分化水平［9］，Ⅰ型膠原是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分，前者表達(dá)取決于后者產(chǎn)生量；OCN 在成骨晚期的表達(dá)隨著細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化而增加，常作為礦化晚期的標(biāo)志物使用［10］。在骨鈣素、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原的調(diào)控序列上，均存在Dlx5 的結(jié)合位點(diǎn)，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化，增強(qiáng)Runx2 基因P1 啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)成骨分化［11］。PPARγ2 正向調(diào)節(jié)脂肪生成，是脂肪細(xì)胞形成合成通路的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［6，12-13］。在分化早期，C／EBPβ 被活化后表達(dá)增加，隨后激活C／EBPα，協(xié)同PPARγ2 共同調(diào)控脂肪分化。本實(shí)驗(yàn)表明，缺少C／EBPβ的胚胎成纖維細(xì)胞脂肪生成能力明顯減低［14］。

《素問(wèn)·陰陽(yáng)臟象大論》指出， “腎主骨生髓，精生髓、髓居其中，髓養(yǎng)骨，骨生髓，聚髓為腦”，故中醫(yī)治療骨病大多以補(bǔ)腎為主。有學(xué)者認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)于中醫(yī)的“精” “髓”［15］，補(bǔ)腎中藥調(diào)節(jié)氧化衰老細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，促進(jìn)精血津液化生，并使之轉(zhuǎn)化為能量，促進(jìn)生長(zhǎng)，就骨骼生長(zhǎng)發(fā)育方面而言，主要體現(xiàn)在促進(jìn)成骨抑制成脂。課題組前期從補(bǔ)腎中藥中選擇補(bǔ)腎陰（六味地黃丸）、補(bǔ)腎陽(yáng)（金匱腎氣丸）、補(bǔ)腎填精（健骨二仙丸［16］），發(fā)現(xiàn)其含藥血清能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境來(lái)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞活性，抑制成脂促進(jìn)成骨。

另外，補(bǔ)腎中藥可防止氧自由基過(guò)量產(chǎn)生，具有抗氧化作用［17］。氧化處理后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量活性氧族，使p16、p21、p53 基因表達(dá)增加而引起早衰，當(dāng)有大量活性氧族在體內(nèi)聚集時(shí)，可通過(guò)p53 作用使得下游靶點(diǎn)p21 抑制CDK／cyclin 復(fù)合體活性，并下調(diào)pRb／E2F軸，降低間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新及再生能力，促進(jìn)衰老，同時(shí)p53／p21 途徑還可通過(guò)與p16／pRb 途徑相互作用來(lái)共同誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)早熟性衰老［18］。本實(shí)驗(yàn)中β-半乳糖苷酶染色和ALP 活性檢測(cè)均顯示，氧化可使細(xì)胞衰老，下調(diào)OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表達(dá)，上調(diào)PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表達(dá)，促進(jìn)成脂分化抑制成骨分化；補(bǔ)腎中藥處理后，增強(qiáng)了衰老細(xì)胞活性，提升OCN、DXL5、OSX、RunX2、TAZ 表 達(dá)，抑 制PPARγ2、C／EBPβ mRNA 表 達(dá)，逆轉(zhuǎn)成脂分化的趨勢(shì)，促進(jìn)成骨分化。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氧化誘導(dǎo)衰老模型，驗(yàn)證了補(bǔ)腎中藥能通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)成骨、成脂相關(guān)因子的表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞外微環(huán)境促進(jìn)精血津液化生，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、成骨分化。但本實(shí)驗(yàn)僅停留在大分子階段，對(duì)于更小分子（如miRNA 等） 的影響還需進(jìn)一步探究。