王立鵬，李永旺，王晨娟，楊玲焰

(蘇州西山生物技術(shù)有限公司，江蘇蘇州 215123)

嗜肺巴斯德桿菌(pasteurellapneumotropica，PP)，屬于巴斯德桿菌科，是一種革蘭氏陰性、不運動、無芽孢的短桿菌或球桿菌，是嚙齒類實驗動物感染率最高的病原菌之一[1]，它有兩種生物型，即 “Heyl”型和“Jawetz”型(簡稱H型和J型)[2]。在實驗動物中，嗜肺巴斯德桿菌是一種條件致病菌，主要感染咽、氣管、肺、子宮、眼部以及腸道等器官，對免疫功能健全的動物一般不會影響健康狀態(tài)，但感染免疫缺陷動物后會引起疾病發(fā)作甚至死亡。嗜肺巴斯德桿菌被認為是感染嚙齒類實驗動物最重要的巴斯德菌科細菌[3]，是國際上和我國國標SPF級嚙齒類實驗動物必須排除的病原菌之一[4]。

嗜肺巴斯德桿菌實驗室診斷方法有細菌分離培養(yǎng)及生化鑒定和PCR檢測方法，我國國標要求的診斷方法是分離培養(yǎng)后生化和血清學鑒定(凝集試驗)[5]。細菌分離及生化鑒定費時、操作繁瑣且敏感度低；PCR方法雖然對實驗條件要求高，但因快速、敏感且特異度強，已成為實驗動物質(zhì)量檢測的重要方法。本研究擬用本公司保存的標準菌株和分離菌株對文獻中報道的四種PCR方法進行敏感度和特異度比較，選擇最佳方法應(yīng)用于臨床氣管和腸內(nèi)容物兩種樣本檢測，并和傳統(tǒng)生化鑒定進行綜合比較，確立適用于嚙齒類實驗動物健康監(jiān)測中嗜肺巴斯德桿菌的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物：來源于2015年不同機構(gòu)送檢的191只SPF級或清潔級小鼠，57只SPF級或清潔級大鼠和64只清潔級沙鼠，來自全國22個不同廠家的312只實驗動物，均活體運輸至本公司，在人道處死后，在生物安全柜內(nèi)按無菌操作采集氣管和腸內(nèi)容物拭子以及相應(yīng)組織。

1.1.2 標準菌株：標準菌株嗜肺巴斯德桿菌J型ATCC 35149，嗜肺巴斯德桿菌H型ATCC 12555，多殺巴斯德桿菌CVCC458等17種菌株購自廣東微生物菌種保藏中心、ATCC全球生物資源中心等，均-70℃保存于本實驗室。

1.2 試劑和儀器 生物安全柜為上海力申科學儀器有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；生化鑒定儀為生物梅里埃公司ATB1525 Expression系統(tǒng)；所有引物均由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成；10×buffer(含Mg2+)，dNTP Mixture，rTaq DNA聚合酶，2×Premix Ex Taq(Probe)，ROX(50×)均為日本Takara公司產(chǎn)品；PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光定量7500 PCR儀(Applied Biosystyem，美國)；凝膠成像分析儀Genosens1560為上海勤翔科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：動物無菌暴露后切下氣管(約5 mm)并放置于含100 μl無菌水的無菌管中充分震蕩漂洗，用無菌棉簽蘸取漂洗液后劃平板培養(yǎng)[6]。暴露結(jié)腸回盲部，用無菌剪刀剪開盲腸壁，用兩支無菌棉簽在無菌水中濕潤后蘸取回盲內(nèi)容物少許用于劃板培養(yǎng)，另外取綠豆大小(約50 mg)腸內(nèi)容物置于無菌管中用于核酸檢測。氣管和腸內(nèi)容物置于-20℃保存待用。

1.3.2 細菌分離及生化鑒定：嚴格按照實驗動物嗜肺巴斯德桿菌檢測方法GB/T 14926.12-2001進行，將各動物的氣管拭子或腸內(nèi)容物拭子在含5 ml/dl脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平皿(血平板)上劃線涂布，36±1℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察菌落大小、顏色和形態(tài)等，挑取灰白色或黃色露滴樣可疑菌落于血平板上三區(qū)劃線分純，36±1℃培養(yǎng)18～24 h，并對分純后的可疑菌落進行革蘭氏染色，確認為革蘭氏陰性的小桿菌，再挑取此菌進行生化鑒定。

1.3.3 DNA提?。焊鶕?jù)細菌基因組DNA提取試劑盒提取標準菌株核酸，用于PCR方法的敏感度和特異度測試。取各動物的氣管(約5 mm)和腸內(nèi)容物樣本(約50 mg)，操作嚴格按照試劑盒說明書提取核酸，-20℃保存待用。

1.3.4 引物合成：嗜肺巴斯德桿菌PCR檢測方法有Dole qPCR，qPCR和Benga PCR三種方法，其中Dole qPCR與Benga mPCR可以分型；另有Bootz普通PCR方法為巴斯德科通用引物。引物見表1。

1.3.5 普通PCR反應(yīng)：程序參考Benga和Bootz設(shè)計的方法。反應(yīng)體系為25 μl，含10×buffer(含 Mg2+)2.5 μl，dNTP Mixture 2 μl，上下游引物各0.5 μl，0.2 μl rTaq DNA聚合酶，5 μl DNA模板和ddH2O 14.3 μl。在PCR儀中95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s(Bootz法退火溫度55℃；Benga法為58℃)，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；之后72℃繼續(xù)延伸7 min。16s rDNA 程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s， 55℃退火45 s， 72℃延伸90 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7 min。1.5 mg/dl瓊脂糖凝膠電泳，電壓為5 V/cm，由凝膠成像分析儀采集電泳結(jié)果。每次實驗中，均設(shè)置質(zhì)粒陽性對照和空白對照。PCR產(chǎn)物送交蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進一步測序，對測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對。

1.3.6 熒光定量PCR反應(yīng)：反應(yīng)程序分別參考DOLE等[7]和高正琴等[8]設(shè)計的方法。反應(yīng)體系為20 μl，含2×Premix Ex Taq(Probe)10 μl，ROX(50×)0.4 μl，上下游引物各0.2 μl，探針0.2 μl，5 μl DNA模板和ddH2O 4 μl。在熒光定量7500 PCR儀中95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸31 s(采集信號)，進行40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學分析 在同一試驗中每個稀釋度標準品(J型菌株核酸)做3個復(fù)孔，以分析組內(nèi)差異。通過統(tǒng)計計算循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)、相對標準偏差 (relative standard deviation，RSD)，驗證該方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

表1 巴斯德菌科，嗜肺巴斯德桿菌以及16s rRNA引物序列

2.1 四種PCR方法的敏感度和特異度比較 以J型標準菌株(ATCC 35149)DNA為模板(3.2×109CFU/ml)，10倍梯度稀釋后分別用于Dole qPCR，Gao qPCR，Benga mPCR and Bootz PCR方法的敏感度實驗，Bootz PCR和Benga普通PCR檢測下限分別為3.2×103CFU/ml和3.2×105CFU/ml(Bootz PCR的特異性目的片段大小為533 bp；Benga mPCR的方法J型目的片段大小為326 bp，H型為451 bp)；而Dole PCR與高正琴qPCR方法敏感度都高達320 CFU/ml。高正琴qPCRCt值組內(nèi)重復(fù)測定RSD值在0.06%～0.38%之間，Dole qPCRCt值在0.20%～1.15%之間，均在可接受的合理范圍內(nèi)。兩對普通PCR引物是巴斯德菌科引物，雖能檢出H型和J型，但也能檢出巴斯德菌科其他細菌，如：多殺巴斯德桿菌和小鼠放線桿菌；Dole qPCR法特異度較強，且對H型和J型PP分型。而高正琴qPCR方法雖敏感度較高，但也能擴增大腸埃希菌、沙門氏菌、假結(jié)核耶爾森菌等多種非巴斯德桿菌科細菌，由于該引物特異度較低，因此后續(xù)試驗中不再采用，4種PCR方法的特異度測試結(jié)果見表2。

表2 嗜肺巴斯德桿菌4種PCR的特異度比較

注：-：PCR陰性；+：PCR陽性。

2.2 疑似嗜肺巴斯德桿菌分離菌株鑒定 用Bootz，Dole和Benga三種PCR方法及ATB生化鑒定法對本實驗室分離留存的76株嗜肺巴斯德桿菌可疑菌進行檢測比較，見表3。

表33種PCR方法與培養(yǎng)法對76株嗜肺巴斯德桿菌疑似菌株的檢測結(jié)果

PCR鑒定方法 培養(yǎng)法陽性數(shù)陰性數(shù)總數(shù)Dole qPCR Benga mPCR Bootz PCR 陽性數(shù)陰性數(shù)陽性數(shù)陰性數(shù)陽性數(shù)陰性數(shù)5196006001511601606610760760

ATB生化鑒定60株為嗜肺巴斯德桿菌(陽性率為78.9%)，但76株可疑菌用Benga mPCR法和Bootz普通PCR法檢測均為陽性(陽性率均為100%)，Dole qPCR方法檢出66株嗜肺巴斯德桿菌(陽性率86.8%，66/76)，34個H型和32個J型，且與Benga mPCR法的分型結(jié)果一致，表明培養(yǎng)的可疑菌株中存在巴斯德菌科中其它菌。10株Dole qPCR陰性的分離菌株用ATB鑒定有9株為嗜肺巴斯德桿菌(其中8株分離自大鼠，1株源于小鼠)，1株陰性(源于倉鼠的分離株)，這10株疑似菌株經(jīng)16S rRNA測序分析表明這些菌株雖為巴斯德菌科細菌，但不是嗜肺巴斯德桿菌，無法確定種屬。

2.3 樣本中嗜肺巴斯德桿菌的檢測 小鼠、大鼠和沙鼠的氣管和腸內(nèi)容物拭子培養(yǎng)分離細菌后生化鑒定，或從樣本中直接提取核酸后用高度敏感、特異的Dole qPCR進行檢測，結(jié)果見表4。這三種動物用細菌分離與生化鑒定法檢測，氣管中陽性率分別為4.2%，15.8%和18.8%，腸內(nèi)容物中陽性率為0.5%，0%和4.7%。Dole qPCR法檢測上述3種嚙齒動物中嗜肺巴斯德桿菌，氣管中陽性率分別為25.7%，28.1%和26.6%，腸內(nèi)容物中陽性率分別為27.2%，29.8%和21.9%。小鼠、大鼠和沙鼠的PCR總陽性率(氣管和/或腸內(nèi)容物陽性)分別為39.3%，35.1%和34.4%，而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢出率僅為4.7%，15.8%和23.4%。Dole qPCR PP檢出率顯著高于國標要求的細菌分離及生化鑒定法。

表4 不同方法檢測三種嚙齒動物的氣管和腸內(nèi)容物中嗜肺巴斯德桿菌陽性率比較[n(%)]

3 討論

現(xiàn)行國標中嗜肺巴斯德桿菌的檢測方法(GB/T 14926.12-2001)仍為分離培養(yǎng)后生化結(jié)合血清學(凝集試驗)鑒定，可疑菌落必須進行生化鑒定，目前生化鑒定試劑大多采用商業(yè)試劑盒，鑒定結(jié)果通過計算機處理、判定，根據(jù)判定值，得出相應(yīng)的鑒定結(jié)果。本公司采用的是ATB1525 Expression系統(tǒng)對76株P(guān)P可疑菌株進行生化項鑒定，鑒定結(jié)果為陽性60株(其中9株經(jīng)PCR方法鑒定為巴斯德菌科細菌)，陰性16株(其中15株經(jīng)PCR方法鑒定為假陰性)，說明ATB1525 Expression系統(tǒng)鑒定嗜肺巴斯德桿菌(包含d-甘露醇、海藻糖、β-葡萄糖苷酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、肌醇、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、尿素酶、α-半乳糖苷酶等)還不能完全區(qū)分巴斯德菌科內(nèi)其它菌種，需要增加更多項生化指標，如吲哚、甘露醇、蜜二糖、棉子糖、甘油、糊精等[12]，另外菌株對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依賴性也可作為鑒定嗜肺巴斯德桿菌的指標。

目前，文獻中有多個嗜肺巴斯德桿菌PCR方法的報道。2009年BOOT等[13]報道的Bootz PCR方法適于檢測巴斯德菌科細菌，且敏感度較高。2010年Dole設(shè)計了qPCR方法，針對H和J型兩種菌株16S rRNA分別設(shè)計檢測探針，達到區(qū)分嗜肺巴斯德桿菌兩種生物型的目的。2012年高正琴等[8]報道了一種新的嗜肺巴斯德桿菌qPCR方法，具有很高的敏感度，檢測靈敏度達22 copies/μl，并可用于嚙齒類實驗動物氣管樣本直接檢測，而不需先培養(yǎng)分離。2013年BENGA等[9]設(shè)計的4重PCR(mPCR)可對嗜肺巴斯德桿菌分型，同時能檢出非PP的巴斯德菌科細菌。我們以嗜肺巴斯德桿菌標準菌株和分離菌株對BOOTZ(1998)，DOLE(2010)，高正琴(2012)和BENGA(2013)4種PCR方法進行了驗證，高正琴等[8](2012)報道的qPCR方法雖然敏感度很高，但特異度較差，通過DNAMAN軟件進行序列分析，發(fā)現(xiàn)該方法使用的引物和探針不特異，與我們實驗結(jié)果相符。2014年，邢進等[14]對306株嗜肺巴斯德桿菌可疑菌株的16S rDNA測序確認有74.2%(227株)為嗜肺巴斯德桿菌，用BD自動生化鑒定儀鑒定的陽性率為53.6%，也反映了生化鑒定的局限性，與我們生化鑒定方法結(jié)果一致。他們也使用了Benga mPCR法(2013)，可檢出所有嗜肺巴斯德桿菌，其中有8.4%(19株)Benga mPCR陽性但不能分型，提示該方法同時可檢出非PP的巴斯德菌科細菌。我們以3種PCR方法和ATB生化鑒定法對76株本室分離的PP可疑菌進行鑒定，結(jié)果表明PCR陽性率顯著高于生化鑒定ATB法，與邢進等[14]報道一致。我們用Benga mPCR與Bootz普通PCR檢測也發(fā)現(xiàn)這兩種方法不能將嗜肺巴斯德桿菌與巴斯德菌科其它細菌相區(qū)分，不適于PP可疑菌株的鑒定，且敏感度較低。相比之下Dole qPCR的靈敏度更高且可達到H型和J型分型的目的，因此Dole qPCR更適于PP 可疑分離株的核酸鑒定。

我國國標要求SPF級小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、沙鼠等嚙齒類實驗動物必須排除嗜肺巴斯德桿菌。國內(nèi)外的嗜肺巴斯德桿菌檢測一般均以咽和氣管為樣本，而對腸道中嗜肺巴斯德桿菌感染情況調(diào)查甚少。小鼠和大鼠腸內(nèi)容物的嗜肺巴斯德桿菌PCR陽性檢出率均高于氣管，雖然沙鼠腸內(nèi)容物陽性檢出率略低于氣管，提示采集糞便用qPCR檢測不失為嗜肺巴斯德桿菌日常監(jiān)測的可行方法，特別是珍貴動物必須活體采樣時。當然單一樣本的qPCR檢測均會產(chǎn)生一定漏檢，同時使用氣管和腸內(nèi)容物樣本可以更精準的反映嗜肺巴斯德桿菌的攜帶或感染狀況。

我們對國內(nèi)多家機構(gòu)提供的SPF級小鼠和大鼠，分別以細菌分離培養(yǎng)生化鑒定法和組織提取核酸PCR法進行檢測，后者不僅檢出培養(yǎng)法所有的陽性樣本，而且直接qPCR檢測樣本陽性檢出率遠高于培養(yǎng)法，可替代ATB鑒定方法。

2017年，嗜肺巴斯德桿菌和親緣性相近的嚙齒類巴斯德菌科細菌被重新歸類為新的嚙齒類桿菌屬(rodentibacter)，該屬包括8個不同的菌種，其中嗜肺巴斯德桿菌的Heyl和Jawetz生物型分別被定義為嚙齒桿菌H型(rodentibacter heylii，R. heylii)和嗜肺嚙齒桿菌(rodentibacter pneumotropicus，R.pneumotropicus)[12]。因此Dole qPCR方法應(yīng)用于嚙齒類實驗動物嗜肺巴斯德桿菌檢測不受分類改變的影響。

總之，Dole qPCR方法直接檢測組織樣本比傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離后生化鑒定方法的敏感度和特異度均大大提高，同時檢測氣管和腸內(nèi)容物可顯著提高嗜肺巴斯德桿菌的陽性檢出率。對需保留活體的珍貴嚙齒類品種采集糞便使用qPCR檢測不失為有效、可行的嗜肺巴斯德桿菌監(jiān)測手段。我國實驗動物中嗜肺巴斯德桿菌的感染率長期被嚴重低估，我們推薦將Dole qPCR方法列入我國嗜肺巴斯德桿菌的檢測國標或團標，以便于更有效監(jiān)測并及時控制、清除該菌。