雷公藤組織培養(yǎng)技術(shù)體系建立

黃淑燕，鄭郁善

(福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000)

雷公藤Tripterygium wilfordii 屬于衛(wèi)矛科Celastraceae 雷公藤屬Tripterygium 植物，多年生落葉蔓性灌木[1]。雷公藤味苦、辛，性涼，大毒，歸肝、腎經(jīng)，是我國(guó)重要的有毒天然藥物資源。雷公藤在中藥材方面具有很大開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，但是大多數(shù)研究主要集中在活性成分鑒定、提取分離及醫(yī)藥應(yīng)用研究等方面。目前，關(guān)于雷公藤組織培養(yǎng)的研究還較匱乏[2—3]。近年來(lái)，市場(chǎng)上對(duì)藥物需求急劇增加以及生物農(nóng)藥供不應(yīng)求，造成對(duì)天然資源的大量開(kāi)采利用，使得雷公藤野生資源枯竭。由于雷公藤自然條件下生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，加上耕地面積逐年減少，僅靠人工栽培難以滿足市場(chǎng)需求。利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得雷公藤再生植株，既可以滿足市場(chǎng)需求，又可以保護(hù)自然資源、維護(hù)生態(tài)環(huán)境，是實(shí)現(xiàn)雷公藤植物資源可持續(xù)利用的重要手段[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤由福建農(nóng)林大學(xué)工業(yè)原料林研究所提供。選取雷公藤當(dāng)年生、半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的帶葉莖段為外植體。

1.2 方法

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)探討雷公藤莖段再生技術(shù)，運(yùn)用方差、極差分析等分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而篩選最優(yōu)組合。

1.2.1 芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 以雷公藤帶葉嫩莖為外植體，以MS 為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度6-BA (0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、NAA (0、0.05、0.10 mg·L-1) 和IBA (0、0.05、0.10 mg·L-1) 進(jìn)行芽體誘導(dǎo)。每處理接種外植體100 個(gè)，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)芽體總數(shù)、萌芽率及增殖系數(shù)。

1.2.2 芽繼代增殖培養(yǎng) 以芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的雷公藤幼嫩外植體為材料，以MS 為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.05、0.1 mg·L-1)及KT(0、0.5、1.0 mg·L-1)增殖培養(yǎng)。每種處理接種外植體100 個(gè)，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和芽體生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 壯苗培養(yǎng) 以繼代增殖培養(yǎng)的雷公藤外植體為材料，以MS 為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA (0、0.5、1.0 mg·L-1)、VB1(0、0.25、0.5 mg·L-1)及蛋白胨(0.5、1.0、1.5 g·L-1)進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。每處理接種外植體100 個(gè)，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和苗木長(zhǎng)勢(shì)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng) 以壯苗培養(yǎng)后的雷公藤幼苗為材料，探討不同含鹽量基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、1/4MS)、不同質(zhì)量濃度NAA (1.0、2.0、3.0 mg·L-1)、KT(0、0.1、0.5 mg·L-1)及蛋白胨(0.5、1.0、1.5 g·L-1)對(duì)生根的影響。每處理接種100 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率、苗木長(zhǎng)勢(shì)及根系生長(zhǎng)情況。

1.2.5 生根粉對(duì)生根培養(yǎng)的影響 以上述生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同種類(lèi)和不同濃度的生根粉ABT1(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、ABT3(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、GGR6(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)，探討生根粉對(duì)生根培養(yǎng)的影響。每處理接種幼苗100 株，3 次重復(fù)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率及幼苗長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.6 煉苗移栽 生根培養(yǎng)30 d 左右，挑選芽體健壯、生長(zhǎng)良好、根系發(fā)達(dá)、株高2 cm 以上的雷公藤外植體瓶苗，常溫閉瓶煉苗3 d，開(kāi)瓶煉苗3 d，然后將小苗取出，用純水洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再將其移栽至消毒基質(zhì)中，壓實(shí)、澆透水，隔3 d 噴灑一次1000 倍杜邦億力。培養(yǎng)過(guò)程中注意基質(zhì)及環(huán)境的保溫保濕，同時(shí)搭建小拱棚遮陰。30 d 后統(tǒng)計(jì)成活率。

移栽基質(zhì)為蛭石、泥炭土等比例混合(1:1)。扦插前一周用0.3%多菌靈與1000 倍杜邦億力按1:1混合進(jìn)行封口消毒5 d，然后通風(fēng)3 d，供培養(yǎng)用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

外植體接入培養(yǎng)基3 d 后開(kāi)始觀察，每隔5 d 觀察一次，待培養(yǎng)一個(gè)周期(30 d)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；煉苗移栽階段，每隔5 d 觀察一次，30 d 后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

污染率=污染外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100%

萌芽率=誘導(dǎo)芽的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100%

增殖系數(shù)=統(tǒng)計(jì)時(shí)芽體總數(shù)/接種芽個(gè)數(shù)

生根率=根系萌發(fā)外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 芽體誘導(dǎo)

由表1 可知，所有處理均能誘導(dǎo)出芽，但萌芽個(gè)數(shù)及萌芽率存在一定差異，出芽個(gè)數(shù)主要表現(xiàn)為腋芽增加及頂芽萌發(fā)。以處理7(MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1)誘導(dǎo)的芽體總數(shù)最多，芽苗長(zhǎng)勢(shì)亦最好。

將雷公藤外植體在芽啟動(dòng)誘導(dǎo)一個(gè)周期(30 d)后所得的芽體增殖系數(shù)進(jìn)行分析，據(jù)均值大小可以判斷出各因子最佳組合為：MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1，即處理7。極差值大小可反映因子的影響程度，細(xì)胞分裂素6-BA 極差值最大，NAA 其次，最后為IBA。因而，各因子對(duì)雷公藤芽誘導(dǎo)影響主次關(guān)系為：6-BA＞NAA＞IBA。

表1 芽體誘導(dǎo)正交設(shè)計(jì)L9(34)試驗(yàn)情況Table 1 Orthogonal array of buds induction

2.2 芽體繼代增殖

結(jié)果表明，芽體增殖系數(shù)隨6-BA 濃度升高而增大，以MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 0.5 mg·L-1(處理9)獲得芽體數(shù)量最多，增殖系數(shù)達(dá)26.7(表2)。

在芽繼代增殖培養(yǎng)一個(gè)周期(30 d)后，對(duì)增殖系數(shù)進(jìn)行方差極差分析(表2)。根據(jù)均值大小可判斷各因子最佳使用濃度。芽增殖階段最佳培養(yǎng)基為：MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1。細(xì)胞分裂素6-BA 極差值最大，NAA 其次，最后為KT，因而，三者對(duì)雷公藤芽增殖影響主次關(guān)系為：6-BA＞NAA＞KT。

2.3 壯苗

對(duì)芽增殖系數(shù)進(jìn)行方差極差分析，結(jié)果顯示，壯苗培養(yǎng)過(guò)程中，既能讓芽苗生長(zhǎng)良好，又能使芽體進(jìn)一步獲得增殖的最佳培養(yǎng)基配方為：MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ VB10.5 mg·L-1+ 蛋白胨0.5 g·L-1，即處理6 培養(yǎng)基(表3)。

據(jù)表3 可知，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及外源添加物不同，外植體長(zhǎng)勢(shì)及芽增殖系數(shù)均不同，以處理6 的芽體增殖系數(shù)最高，且芽長(zhǎng)勢(shì)健壯、顏色翠綠，因而為雷公藤壯苗培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方。據(jù)極差可知，對(duì)雷公藤壯苗培養(yǎng)影響因子的主次關(guān)系為：6-BA＞蛋白胨＞VB1。

表2 芽繼代增殖培養(yǎng)正交設(shè)計(jì)L9(34)Table 2 Orthogonal array of buds subculture

表3 壯苗培養(yǎng)正交設(shè)計(jì)L9(34)Table 3 Orthogonal array of seedling cultivation

2.4 生根培養(yǎng)

對(duì)生根率均值極差分析顯示，最佳生根培養(yǎng)基組合為1/2MS + NAA 2.0 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1，各影響因子以基本培養(yǎng)基影響最大，NAA 次之，最后為KT(表4)。

但正交試驗(yàn)處理4 和處理5 的生根率均已達(dá)100.0%，且苗木長(zhǎng)勢(shì)好，根系粗壯，生根快，根量多，因此，均適于雷公藤生根培養(yǎng)，操作中可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)選擇(表4)。

表4 生根培養(yǎng)試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)L9(34)Table 4 Orthogonal array L9(34) of rooting culture

據(jù)表5 可知，三種生根粉均可在不同程度上誘導(dǎo)生根，1.0 mg·L-1ABT3(處理5)及1.0 mg·L-1GGR6(處理8) 獲得最大根量數(shù)，分別為19.4 條、19.0 條；對(duì)于ABT1，使用濃度為1.5 mg·L-1時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，平均根量也最多。三種生根粉對(duì)雷公藤生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基組合分別為1/2MS + ABT11.5 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1；1/2MS + ABT31.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1；1/2MS + GGR61.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 瓊脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1。

表5 不同生根粉對(duì)生根培養(yǎng)的影響Table 5 The effects of different concentration of ABT1, ABT3, GGR6 on rooting culture

2.6 煉苗移栽

雷公藤組培苗移栽培養(yǎng)30 d 后觀察發(fā)現(xiàn)，組培苗移栽后成活率達(dá)84.5%，且苗長(zhǎng)勢(shì)良好、葉片翠綠。因此，本試驗(yàn)煉苗移栽方法適用于雷公藤煉苗移栽。

3 討論

3.1 芽誘導(dǎo)分化與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)間關(guān)系

通常情況下，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配合使用時(shí)，過(guò)高的生長(zhǎng)素會(huì)導(dǎo)致愈傷組織大量產(chǎn)生并且誘導(dǎo)根系形成，對(duì)芽的誘導(dǎo)不利，因此進(jìn)行芽及愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，要求高比值的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素[5—8]。本試驗(yàn)中，1.5 mg·L-16-BA 與0.1 mg·L-1IBA 濃度配合利于莖段芽誘導(dǎo)(即細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例為15:1)，但添加NAA 對(duì)芽誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用，反而有抑制作用。

3.2 繼代增殖培養(yǎng)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)間關(guān)系

外源細(xì)胞分裂素可破除外植體頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)分化及生長(zhǎng)發(fā)育。由于外植體在芽誘導(dǎo)過(guò)程中，已利用細(xì)胞分裂素助其腋芽發(fā)生，因而在增殖培養(yǎng)時(shí)，可在原先濃度上進(jìn)行適當(dāng)降低[5—8]。本試驗(yàn)中，在芽增殖階段，為了獲得較高增殖系數(shù)，1.0 mg·L-16-BA 與0.1 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1KT 搭配最佳，增殖系數(shù)最高；比較芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與增殖培養(yǎng)的細(xì)胞分裂素濃度發(fā)現(xiàn)，繼代增殖培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞分裂素使用濃度低于啟動(dòng)培養(yǎng)，原因在于內(nèi)源激素及植物體自身的激素合成能力的影響。

3.3 壯苗培養(yǎng)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)間關(guān)系

研究表明，壯苗培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中添加一定濃度GA3有利于芽苗增粗生長(zhǎng)，同時(shí)維生素類(lèi)及蛋白胨等外源有機(jī)添加物均能提高植株生活力。此外，該階段應(yīng)降低細(xì)胞分裂素用量，防止芽體再次增殖生長(zhǎng)[5—8]。雷公藤主要采用細(xì)胞分裂素6-BA、VB1及蛋白胨進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。結(jié)果顯示，三者使用濃度及配比對(duì)壯苗培養(yǎng)有顯著影響，蛋白胨濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致芽苗營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩而燒苗，VB1濃度過(guò)低不能達(dá)到預(yù)期效果。

3.4 生根培養(yǎng)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)間關(guān)系

對(duì)于生根培養(yǎng)，高離子濃度培養(yǎng)基可能對(duì)植物根系產(chǎn)生毒害作用，低離子濃度培養(yǎng)基對(duì)生根更有利，因此在使用MS 作為生根培養(yǎng)基本培養(yǎng)基時(shí)，可采用1/2MS(大量元素濃度減半，其他成分含量不變)[5—8]。本試驗(yàn)中，生根培養(yǎng)主要采用NAA、KT 兩種植物激素。結(jié)果表明，三種因素對(duì)雷公藤生根率影響的主次關(guān)系為基本培養(yǎng)基＞NAA＞KT；在雷公藤生根試驗(yàn)中，低離子濃度利于根系誘導(dǎo)，單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用效果不明顯，應(yīng)配比相應(yīng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素，且兩者比值高有利于生根。