Folin-Ciocalteu比色法測定昭通青花椒總酚含量

熊汝琴，李平，王銳

(昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000)

青花椒(Zanthoxylumschinifolium)為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物青椒的干燥果皮，又名香椒子、崖椒、野椒、青椒、狗椒。因其麻味純正、氣味清香、顏色清爽而在各地菜肴尤其是川菜中廣泛使用，深受消費者喜愛。青花椒不僅是常用調味品，也是《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥材，具有溫中止痛、殺蟲止癢的功能，可用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛、濕疹瘙癢等癥狀[1-3]。青花椒喜光、耐寒、耐旱，對生長環(huán)境的適應能力較強，在我國栽培歷史悠久，分布范圍廣泛，四川金陽、重慶江津、貴州、云南等地已經把青花椒作為主要的經濟作物之一。云南省昭通地區(qū)因其獨特的海拔及光熱條件，非常適合青花椒種植，目前種植面積已超過100萬畝，產量約占全省的60.0%～70.0%。近年來，昭通市高度重視青花椒產業(yè)發(fā)展，青花椒在種植規(guī)模、管理水平、產品品質上具有較大提高。

目前，大多數(shù)對花椒化學成分的研究報道主要集中于陜西、甘肅、四川、重慶等全國聞名的花椒種植基地所產花椒，主要以研究揮發(fā)油、酰胺類化合物、生物堿、黃酮等為主[4-11]。近年來，花椒中的酚性成分因具有獨特的藥理活性而受到關注。研究表明花椒多酚粗提物具有較強的抗氧化能力和清除自由基能力[12，13]，在動物實驗中顯示出抗抑郁作用，改善D-半乳糖衰老模型小鼠的學習記憶能力，改善老年癡呆癥狀的作用[14-16]。但是，由于產地的氣候、雨量、日照和土質等諸多自然因素的不同，不同產地花椒的化學組成及含量有很大差異。而昭通青花椒的種植面積雖不斷擴大，但對其化學成分的系統(tǒng)研究卻鮮有報道，缺乏理論數(shù)據(jù)的支撐，加上臨近四川、重慶等花椒種植基地，使昭通青花椒的市場競爭力較弱，品牌效應不高。因此，本文采用Folin-Ciocalteu比色法測定昭通幾個縣區(qū)所產青花椒總酚成分含量，期望增加昭通青花椒的附加值，為青花椒的質量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒樣品分別采于昭通市大關縣、鹽津縣、魯?shù)榭h、永善縣、彝良縣、巧家縣和鎮(zhèn)雄縣。

Folin-Ciocalteu試劑：AR，國藥集團化學試劑有限公司；無水Na2CO3：AR，天津市福晨化學試劑廠；沒食子酸標準品：中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用；無水乙醇：AR，成都市聯(lián)合化工試劑研究所；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

HH-S24型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇儀器廠；SK3200HP型超聲提取器 上?？茖С晝x器有限公司；YB-150型高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿有限公司；3111000831型移液器 德國 Eppendorf公司；UV756紫外可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

將昭通各縣區(qū)青花椒粉碎，過30目篩，分別稱取2.0000 g花椒粉，加60%乙醇50 mL，25 ℃超聲提取[17]，常溫過濾制得花椒樣液。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取0.1000 g沒食子酸標準品，蒸餾水溶解定容至100 mL，準確移取1.0 mg/mL沒食子酸標準溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸餾水，再加入Folin-Ciocalteu試劑1.00 mL并搖勻，靜置2～3 min，加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸餾水定容，在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應120 min，在765 nm處分別測定吸光度，以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 青花椒中總酚含量的測定

精確吸取0.10 mL花椒樣液，加60 mL蒸餾水，再加入1.00 mL福林酚試劑，搖勻，放置2～3 min后，加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至100 mL，置于25 ℃恒溫水浴鍋中顯色120 min，于765 nm處測吸光度，按標準曲線計算濃度，代入公式求總酚含量。

式中：ω為總酚含量(mg/g)；C為沒食子酸質量濃度(μg/mL)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為取樣量(g)。

2 結果與分析

2.1 超聲提取時間的選擇

準確稱取2.0000 g大關產青花椒粉末，加入60%50 mL乙醇溶液，于25 ℃分別超聲提取10～80 min(10 min/次)，常溫下分別過濾制得花椒樣液，精確吸取0.10 mL樣品液于100 mL容量瓶中，依次加入60 mL蒸餾水，1.00 mL福林酚試劑，搖勻，放置2～3 min，加入5.00 mL 10% Na2CO3溶液后用蒸餾水定容，在25 ℃水浴鍋中顯色120 min后于765 nm處測定吸光度，結果見表1和圖1。

圖1 提取時間與吸光度的關系Fig.1 The relationship between extraction time and absorbance

由圖1可知，提取時間達60 min后吸光度隨時間增加不明顯，因此選擇60 min作為超聲提取時間。

2.2 顯色反應條件的確定

2.2.1 Na2CO3溶液用量的確定

準確稱取2.0000 g大關產青花椒粉末，加入60%的乙醇50 mL，于25 ℃超聲提取60 min，常溫下過濾制得花椒樣液。準確移取0.10 mL花椒樣液于100 mL容量瓶中加入蒸餾水60 mL，再加入福林酚試劑1.00 mL并搖勻，靜置2～3 min，分別加入不同體積的10% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，在25 ℃恒溫水浴鍋中顯色120 min，于765 nm處測吸光度，結果見表2和圖2。

表2 Na2CO3溶液用量的確定實驗Table 2 Experiment for determining the dosage of Na2CO3 solution

圖2 Na2CO3溶液用量與吸光度的關系Fig.2 The relationship between the dosage of Na2CO3 solution and absorbance

由圖2可知，當10% Na2CO3溶液的體積為5.00 mL時效果最佳，因此確定10% Na2CO3溶液用量為5.00 mL。

2.2.2 顯色時間的確定

準確移取0.10 mL大關產青花椒樣液，于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸餾水，再加入1.00 mL福林酚試劑并搖勻，靜置2～3 min，加入10%的Na2CO3溶液5.00 mL后用蒸餾水定容，在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應20 min后開始，每隔20 min在765 nm處分別測定吸光度，結果見表3和圖3。

表3 顯色時間的確定實驗Table 3 Experiment for determining chromogenic time

圖3 顯色時間與吸光度的關系Fig.3 The relationship between chromogenic time and absorbance

由圖3可知，顯色反應在120 min后趨于穩(wěn)定,因此選擇顯色反應時間為120 min。

2.3 標準曲線的繪制

準確移取1.0 mg/mL沒食子酸標準溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL蒸餾水，再加入Folin-Ciocalteu試劑1.00 mL并搖勻，靜置2～3 min，加入10%的Na2CO35.00 mL后用蒸餾水定容，在25 ℃恒溫水浴鍋中放置反應120 min，在765 nm處測定吸光度，結果見表4和圖4。

表4 標準曲線繪制實驗Table 4 Experiment for drawing standard curve

圖4 標準曲線Fig.4 The standard curve

由圖4可知，沒食子酸濃度在0～5 μg/mL內與吸光度線性關系良好，線性回歸方程y=0.0873x+0.0095，r=0.9991。

2.4 加標回收率實驗

準確吸取大關青花椒樣液0.10 mL，分別加入0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mL的1.0 mg/mL沒食子酸標準溶液，按2.3實驗方法測吸光度并計算回收率，結果見表5。平均回收率為100.1%，表明采用Folin-Ciocalteu比色法測定昭通青花椒總酚含量具有良好的精密度、準確性和穩(wěn)定性，測定結果準確可靠。

表5 加標回收率實驗Table 5 Recovery rate experiment

2.5 昭通青花椒總酚含量測定

分別取昭通市大關、鹽津、魯?shù)?、永善、彝良、巧家、?zhèn)雄幾個縣區(qū)所產青花椒樣品，按前述2.1制取樣品液，按2.2確定實驗條件進行顯色反應后測定吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算總酚含量，平行測定5份，計算結果見表6。

表6 昭通青花椒總酚含量測定Table 6 Determination of total phenols in Zhaotong Zanthoxylum schinifolium

鎮(zhèn)雄縣青花椒總酚平均含量為52.57 mg/g，RSD為0.43%；彝良縣青花椒總酚平均含量為53.54 mg/g，RSD為0.90%；永善縣青花椒總酚平均含量為53.96 mg/g，RSD為0.17%；巧家縣青花椒總酚平均含量為54.25 mg/g，RSD為0.80%；魯?shù)榭h青花椒總酚平均含量為57.12 mg/g，RSD為0.61%；鹽津縣青花椒總酚平均含量為58.77 mg/g，RSD為0.54%；大關縣青花椒總酚平均含量為62.07 mg/g，RSD為0.92%；重復性較好。

3 結論

花椒中的酚性成分具有多種重要生理作用，本文以60%乙醇溶液在25 ℃超聲1 h提取昭通青花椒酚性成分。采用Folin-Ciocalteu比色法，確定10% Na2CO3溶液用量為5.00 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑用量為1.00 mL，顯色時間為120 min，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，y=0.0873x+0.0095，r=0.9991，濃度在0～5 μg/mL內與吸光度線性關系良好。按以上實驗條件測得昭通七縣區(qū)青花椒總酚含量范圍為52.57～62.07 mg/g，平均總酚含量為56.04 mg/g，回收率為100.1%，相對標準偏差(RSD)為0.39%。結果表明該方法操作簡便，重復性好，檢測結果準確可靠，可為昭通青花椒的品質研究提供實驗參考。