楊承忠 張雕雕 趙元莙

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

吳李碘泡蟲Myxobolus wulii(Wu & Li) Landsberg & Lom, 1991, 隸屬于黏體門Myxozoa, 雙殼目Bivalvulida, 碘泡科Myxobolidae, 最初由Wu & Li于1986年在我國鯽Carassius auratus auratusLinnaeus的鰓絲中檢獲并命名為大型黏體蟲Myxosoma magnaWu & Li, 1986。隨后又在白鰱Hypophthalmichthys molitrixValenciennes、青Leiocassis brashnikowiBerg、馬口魚Opsariichthys bidensGünther陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有該寄生蟲的寄生[1,2]。然而, 早在1984年, 就有學者建議將黏體蟲屬MyxosomaThélohan, 1892的所有種合并至碘泡蟲屬MyxobolusBütschli, 1882中, 并修正其屬名為碘泡蟲屬Myxobolus[3], 該觀點被學界廣為接受[4]。按照國際動物命名法規(guī), 大型黏體蟲Myxosoma magna修正后學名應為大型碘泡蟲。由于該學名已有物種Myxobolus magnusAwerinzew, 1913占用, 因此, Landsberg & Lom將其重新命名為吳李碘泡蟲Myxobolus wuliiLandsberg & Lom, 1991。先前的研究一直認為吳李碘泡蟲M. wulii、寄生于異育銀鯽C. auratusgibelioBloch肝胰臟的關(guān)橋碘泡蟲M. guanqiaoensisWu & Wang, 1997[5]以及寄生于日本金魚鰓絲的碘泡蟲未定種M.sp. Yokoyama,et al. 1992[6]是3個不同的種。繼后, Zhang等[7]綜合形態(tài)和分子數(shù)據(jù),指出這三者實際上均為吳李碘泡蟲M. wulii。吳李碘泡蟲長江中游(湖北段)和下游(江蘇段)株系(含有分子數(shù)據(jù)的)均有過報道[7—9], 而近期我們又在長江流域重慶段獲得了長江上游株的數(shù)據(jù), 同時這3個地理株系(下文統(tǒng)一分別稱為： 吳李碘泡蟲重慶株、湖北株和江蘇株)中又有宿主類型和寄生部位等的差異?；诖? 我們在對吳李碘泡蟲進行重描述的基礎(chǔ)上進一步對這三大地理株系進行了比較研究, 以期更深入的了解吳李碘泡蟲這一魚類重要寄生蟲的種群演化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 標本的采集與物種的鑒定

宿主鯽C. auratus auratus樣本分別于2017 年11 月和2018年4月采自長江流域重慶段, 感染率分別為25% (8尾中2尾感染)和10% (10尾中有1尾被感染)。在被感染的宿主魚鰓部可以觀察到吳李碘泡蟲孢囊, 該寄生蟲標本的檢獲及處理參考文獻[10]完成。

1.2 DNA 提取與 PCR 擴增

DNA 提取將獲得的吳李碘泡蟲孢囊立即鏡檢, 顯微拍照, 再用溶質(zhì)體積分數(shù)為95%的乙醇溶液保存于離心管中, 首先從裝有實驗材料的離心管底部吸取10 μL獲得的黏孢子蟲液體, 經(jīng)超純水清洗2—3次以除去雜質(zhì), 再進行基因組DNA的提取。DNA抽提采用Dneasy Tissue Kit (QIAGEN,Germany)試劑盒, 操作方法按照廠家提供的說明書步驟進行。提取完成的基因組DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增用于擴增18S rDNA基因的引物分別為ERIB1(5′-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和ERIB10 (5′-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3′)[11], 當?shù)谝惠單磾U增到目的片段時, 換用引物18E(5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)[12]和18R (5′-CTACGGAAACCT TGTTACG-3′)[13]。PCR反應體系如下： 10×ExTaqbuffer (Mg2+free) 2.5 μL, 25 mmol/L的MgCl22.5 μL, 25 mmol/L的dNTP 2.5 μL, 10 μmol/L的引物各0.5 μL, 1.2 ng的模板DNA, 5 U/μL的ExTaq酶0.2 μL, 最后用滅菌超純水補足至終體積25 μL。PCR反應條件為： 95℃預變性5min; 95 ℃變性50s,58℃退火1min, 72℃延伸2min, 35個循環(huán); 最后72℃延伸10min。取3 μL PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中檢測, 然后將有目的條帶的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit (OMEGA, America)純化回收并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序(ABI,3730XL測序儀)。

1.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育

序列的選取將本研究獲得的2條吳李碘泡蟲18S rDNA序列分別在GenBank中通過BLAST進行序列同源性比對。根據(jù)比對結(jié)果, 選取同源性較高的29條碘泡蟲序列, 包括本研究得到的2條吳李碘泡蟲序列。另外選取Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(AY074915)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

18S rDNA 序列分析通過Clustal W程序按照缺省參數(shù)進行序列多重比對, 序列相似度的計算用在線序列雙重比對工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)計算獲得。所選序列進行兩兩之間的遺傳距離利用MEGA 6.0[14], 選擇K2P模型計算完成。

系統(tǒng)樹的構(gòu)建利用在線軟件The CIPRES Science Gateway V. 3.1 (http：//www.phylo.org/sub_sections/portal/)構(gòu)建Maximum-likelihood (ML)樹,選用模式為RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.10)[15—17],Bayes (BI)樹在MrBayes 3.1.2軟件[18]中構(gòu)建, 位點變異設(shè)置為invgamma分布, 序列最佳進化模型為GTR+I+G, 運行1000000代。最后用FigTree v1.4.2和Photoshop CS3完成系統(tǒng)樹的繪制。

2 結(jié)果

2.1 吳李碘泡蟲重慶株系形態(tài)學重描述

吳李碘泡蟲重慶株系, 其成熟孢子殼面觀為長卵形, 縫面觀呈梭形, 前端稍尖后端鈍圓, 孢子表面光滑, 2個極囊等大、長梨形, 并列呈“八”字形于孢子前端, 極囊約占孢子體積的1/2, 極絲清晰可見約7—9圈。孢子量度(n=40)為： 孢子長(14.45±0.70) μm(13.06—15.93 μm), 孢子寬(9.87±0.87) μm (8.07—11.17 μm); 極囊長(7.67±0.63) μm (6.54—8.31 μm),極囊寬(3.90±0.22) μm (3.49—4.27 μm) (圖 1、表 1)。宿主魚未發(fā)現(xiàn)明顯病癥。

2.2 吳李碘泡蟲 18S rDNA 分子特征

測得吳李碘泡蟲重慶株系的2條18S rDNA序列長度分別為1921和1912 nt, 將序列提交至Gen-Bank, 登錄號分別為MH920541和MH920542。吳李碘泡蟲的18S rDNA經(jīng)BLAST比對的結(jié)果顯示,在可比范圍內(nèi), 本研究得到的吳李碘泡蟲重慶株系與湖北株系(序列登錄號為KJ725081和EF690300)和江蘇株系(序列登錄號為HQ613412)相似度在99%以上(99.2%—99.9%, 表 2)。

遺傳距離分析結(jié)果顯示, 本研究獲得的吳李碘泡蟲重慶株系兩序列(MH920541和MH920542)之間的遺傳距離為0.001, 重慶株系分別與湖北株系(KJ725081和EF690300)、江蘇株系(HQ613412)的遺傳距離均為0.007; 湖北株系兩序列(KJ725081和EF690300)之間的遺傳距離為0.001; 湖北株系與江蘇株系的遺傳距離均為0.002 (表 2)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

基于18S rDNA構(gòu)建的ML和BI樹呈現(xiàn)出一致的拓撲結(jié)構(gòu)(本文只呈現(xiàn)BI樹, 圖 2)。所有碘泡蟲物種分為2大支系(A支和B支)。在B支系中, 所有吳李碘泡蟲聚成一支, 該支系與瓶囊碘泡蟲和洪湖碘泡蟲構(gòu)成的進化枝形成姐妹群關(guān)系。在吳李碘泡蟲支中, 重慶株系聚成一支最先分化, 湖北和江蘇株系聚成另外一支后分化。其中, 吳李碘泡蟲湖北株系和江蘇株系并未形成地理種群特有的進化枝,而是相互交叉成枝(圖 2)。

3 討論

本研究獲得的吳李碘泡蟲重慶株系孢子及極囊均比湖北株系略小, 湖北株系兩個極囊在大小上略有差異, 而重慶株系兩個極囊等大(表 1)。江蘇株系由于無形態(tài)學數(shù)據(jù), 無法比較。以往諸多基于18S rDNA為分子標記的黏孢子蟲物種鑒定方面的研究表明, 絕大多數(shù)黏孢子蟲的種內(nèi)相似度范圍為98.6%—100%, 而種內(nèi)遺傳距離范圍大多數(shù)集中在0.000到0.007[19—22]。本研究吳李碘泡蟲三大地理株系序列相似度(99.2%—99.9%)和遺傳距離(0.002—0.007)分析的結(jié)果顯示三大地理株系均為同一物種。因此, 盡管各地理株系在形態(tài)量度上存在一定差異, 但從分子水平上看, 均在種內(nèi)水平的形態(tài)變異。而這些差異可能與地理環(huán)境、宿主種類及感染部位有關(guān)。

圖 1 吳李碘泡蟲重慶株系孢子形態(tài)圖Fig. 1 Morphology of M. wulii from Chongqing strain

表 1 長江流域吳李碘泡蟲M. wulii不同株系的形態(tài)學比較Tab. 1 Morphological comparison of different strains of M. wulii in the Yangtze River Basin

一般而言, 對于自由生活的動物, 地理隔離在種群分化中起著重要作用, 而長距離的地理隔離是導致自然種群分化的重要因素。從遺傳距離及相似度來看, 三大地理株系之間的遺傳變異并不能反映地理隔離與種群分化之間的必然聯(lián)系(表 2、圖 2)。以往的研究表明, 對于寄生生活的寄生蟲種群變異受宿主種類的影響強于受地理隔離的影響[23—26]。然而, 系統(tǒng)發(fā)育分析并未顯示所有寄生于鯽的吳李碘泡蟲之間具有更近的親緣關(guān)系, 如宿主為鯽的江蘇株系(HQ613412)卻與宿主為異育銀鯽的湖北株系1(EF690300)聚為一支(圖 2)。也有研究表明寄生蟲積極地轉(zhuǎn)移棲息地時, 通過寄生部位的選擇也會導致物種種群分化甚至形成新種[23]。本研究鰓寄生與肝胰臟寄生的吳李碘泡蟲分別聚為兩大支系, 且鰓寄生支系先分化出來(圖 2)。這表明, 相同寄生部位的吳李碘泡蟲具有更近的親緣關(guān)系, 且鰓寄生的吳李碘泡蟲株系相對原始。這可能與體表寄生和體內(nèi)寄生的演化有關(guān)： 與體內(nèi)寄生相比, 寄生于鰓所需克服的宿主保護屏障較少。而在宿主身體內(nèi)部寄生, 不僅要克服更多的保護屏障,還會受到宿主免疫反應等的排斥作用。因此, 鰓寄生的吳李碘泡蟲可能是較早定居的群體, 隨著其不斷進化, 侵入宿主的能力加強, 逐漸分化出在肝胰臟寄居的吳李碘泡蟲群體。由于18S rDNA序列的保守性, 所含信息可能不足以完全說明吳李碘泡蟲三大株系之間的自然演化規(guī)律。因此, 增加ITS-1 rDNA等高變異分子標記及增加樣本量應是今后研究吳李碘泡蟲種群分化規(guī)律優(yōu)先開展的工作。雖然18S rDNA序列較為保守, 但本研究顯示吳李碘泡蟲不同江段株系序列間已有變異, 這表明吳李碘泡蟲已出現(xiàn)一定程度的分化, 形成了不同的種群。

表 2 四種相似碘泡蟲基于18S rDNA序列的相似度與遺傳距離Tab. 2 Similarities and genetic distances of four similar Myxobolus species (12 sequences) based on 18S rDNA sequences

圖 2 基于18S rDNA序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree generated by BI based on the 18S rDNA gene sequences