劉春榮 張榮菊 田亮

摘要：目的 ?分析淋巴結(jié)冰凍切片的影響因素，以提高淋巴結(jié)冰凍切片質(zhì)量。方法 ?收集我院2016年1月～2018年12月臨床送檢的331例乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)冰凍切片，通過(guò)對(duì)取材、包埋、制片等各個(gè)環(huán)節(jié)的分析，探討冰凍制片中出現(xiàn)的問(wèn)題，總結(jié)冰凍切片的操作技巧和改良方法。結(jié)果 ?331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢中，有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2 mm。其余冰凍切片質(zhì)量較好，組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，染色分明，少有冰晶形成。結(jié)論 ?通過(guò)規(guī)范操作細(xì)節(jié)調(diào)整改進(jìn)，制作高質(zhì)量冰凍切片，對(duì)診斷乳腺癌前哨淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移特異性較高，是一種較為可靠而快速的診斷方法。

關(guān)鍵詞：前哨淋巴結(jié);冰凍切片;乳腺癌;制片

中圖分類(lèi)號(hào)：R361+.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.18.068

文章編號(hào)：1006-1959（2019）18-0190-03

Abstract：Objective ?To analyze the influencing factors of frozen section of lymph nodes to improve the quality of frozen sections of lymph nodes. Methods ?The frozen sections of sentinel lymph nodes in 331 cases of breast cancer were collected from January 2016 to December 2018 in our hospital. Through the analysis of various aspects such as material extraction， embedding， and film production， the problems in frozen film production are discussed， and the operation techniques and improvement methods of frozen section are summarized.Results ?The 331 cases of sentinel lymph node biopsy， 2 cases had false negatives. The pathological diagnosis of paraffin sections revealed a micrometastase of 2 mm. The remaining frozen sections have good quality， complete tissue structure， clear cell morphology， distinct staining， and few ice crystal formations.Conclusion ?It is a reliable and rapid method to diagnose high-quality frozen sections by standardizing the operation details and improving the high specificity of sentinel lymph node metastasis.

Key words：Sentinel lymph node;Frozen section;Breast cancer;Making section

前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）是原發(fā)腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)中的特殊淋巴結(jié)，是原發(fā)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第一批淋巴結(jié)，其組織病理學(xué)狀態(tài)可代表整個(gè)區(qū)域淋巴結(jié)的可能狀態(tài)。前哨淋巴結(jié)活檢能較準(zhǔn)確的評(píng)估早期乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)[1]。前哨淋巴結(jié)的術(shù)中冰凍切片檢查是乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)的有效且可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2，3]，故前哨淋巴結(jié)術(shù)中冰凍切片準(zhǔn)確診斷極為重要。冰凍切片檢查可以最早的了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，以利于確定是否需要徹底掃除腋窩淋巴結(jié)或者其它的治療措施。但冰凍切片是在低溫恒冷條件下，使組織迅速冷凍達(dá)到一定硬度制成的切片，一般要求15 min內(nèi)完成，在制片工作中存在局限性，尤其淋巴結(jié)組織細(xì)胞致密，組織低溫易脆，制片存在困難，故本文將乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)傳統(tǒng)制片方法加以探討與改進(jìn)，以期不斷提高淋巴結(jié)的術(shù)中冰凍切片質(zhì)量。

1資料與方法

1.1一般資料 ?收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州市中心醫(yī)院2016年1月～2018年12月收治的331例臨床原發(fā)性乳腺癌女性患者的手術(shù)中切除前哨淋巴結(jié)送檢病理組織。

1.2方法

1.2.1儀器及材料 ?采用德國(guó)產(chǎn) Leiea CM1950型恒溫冷凍切片機(jī)，OCT包埋劑，AAF固定液，蘇木素伊紅染液，梯度酒精，二甲苯。

1.2.2取材 ?術(shù)中送檢新鮮淋巴結(jié)剔除脂肪組織，沿長(zhǎng)軸取材，厚度0.2～0.3 cm，如果淋巴結(jié)體積較小，則去除脂肪直接包埋切片。

1.2.3包埋 ?將取材淋巴結(jié)置于-18℃冷凍切片機(jī)內(nèi)組織樣本托上，樣本托需提前放置恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)制冷，先加少量包埋劑打底，然后迅速放置組織，在組織周?chē)渭影駝┓€(wěn)固，待組織固定后，將冷凍錘輕壓在組織表面，使組織和周?chē)闹蝿┢秸鋮s后切片。

1.2.4制片 ?淋巴結(jié)切片厚度4～5 μm，將組織粘附于載玻片下2/3與下1/3交界處，取片完成后立即放入AAF混合固定液（95%乙醇85 ml、40%甲醛10 ml、冰醋酸5 ml）中充分固定[4]。AAF混合固定液能迅速固定染色質(zhì)，且固定效果均勻，固定時(shí)間至少1.5 min，固定后切片充分水洗，harris蘇木素及伊紅染色，梯度酒精脫水二甲苯透明中性樹(shù)膠封片。

1.2.5固定冰凍組織塊 ?冰凍制片完成，再發(fā)完冰凍報(bào)告后冰凍組織塊及時(shí)取下投入固定液，繼續(xù)下一步石蠟常規(guī)脫水處理程序。

2結(jié)果

331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢中，有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2 mm。余冰凍切片平整，厚薄均勻、無(wú)皺折，鏡下淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)完整，染色鮮明，細(xì)胞形態(tài)清晰，無(wú)腫脹及明顯收縮，無(wú)空泡及少有冰晶形成，完全滿(mǎn)足診斷需要（圖1），若操作不當(dāng)，造成淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破碎，組織空洞，細(xì)胞擠壓影響閱片診斷（圖2）。

3討論

提高乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)快速冰凍切片質(zhì)量，涉及取材、包埋、切片等各個(gè)環(huán)節(jié)。乳腺癌術(shù)中送檢前哨淋巴結(jié)往往脂肪包裹，由于脂肪組織冷凍效果差，取材盡量剔除脂肪組織，對(duì)于難以剔除脂肪組織，可以用吸水吸油擦手紙或者廚房紙輕柔按壓盡量吸去脂肪效果較好，注意動(dòng)作輕柔勿壓傷細(xì)胞。之后沿長(zhǎng)軸取材淋巴結(jié)，組織厚度≤0.3 cm，注意取材過(guò)厚延長(zhǎng)冷凍時(shí)間，容易產(chǎn)生冰晶，影響鏡下閱片診斷，傳統(tǒng)組織取材厚度≥0.5 cm影響制片效果。

組織包埋時(shí)，一般實(shí)驗(yàn)室樣本托在常溫放置，冰凍操作過(guò)程中會(huì)延長(zhǎng)組織與樣本托固定與冷凍時(shí)間。本研究中將樣本托提前放置于恒溫冷凍切片機(jī)中預(yù)冷，可以使組織迅速冷凍。滴加包埋劑放置組織，在組織周?chē)渭影駝┓€(wěn)固，待組織底部固定后用冷錘按壓，避免重壓組織導(dǎo)致過(guò)度變形，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組織取材薄平整，預(yù)冷樣本托，冷錘冷卻按壓可以加速組織冷凍。對(duì)于送檢多個(gè)淋巴結(jié)，需準(zhǔn)備多個(gè)樣本托分別冷凍，切忌不能將送檢所有淋巴結(jié)放到一個(gè)組織樣本托制片，增加切片難度。對(duì)于個(gè)別淋巴結(jié)組織體積較小，可以由包埋劑充分包裹制片有利于切出完整帶被膜淋巴結(jié)組織，避免卷邊。另外，市售液體膠水可以替代進(jìn)口包埋劑，切片效果良好，且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便價(jià)格低廉，可以作為很好的替代品[5]。注意包埋劑用量，包裹組織但不可過(guò)量，以免延長(zhǎng)冷凍時(shí)間。

恒溫冷凍切片機(jī)一般冷凍工作室溫度控制在-24℃～-20℃，淋巴結(jié)組織冷凍后易變脆，切片易碎裂，溫度不能太低，一般在-18℃～-17℃比較合適[6]。我們將冷凍工作室溫度調(diào)至-18℃制作淋巴結(jié)冰凍切片，對(duì)于送檢部分脂肪浸潤(rùn)淋巴結(jié)組織，冷凍難以制片，徠卡 Leiea CM1950 型恒溫冷凍切片機(jī)可以啟動(dòng)單獨(dú)樣本頭速凍功能，將冷凍樣本頭溫度下降至-50℃～-35℃切片，切片完成后上調(diào)與恒溫冷凍切片機(jī)冷凍工作室溫度一致或高于冷凍工作室溫度，以保護(hù)壓縮機(jī)，提高冰凍切片機(jī)使用壽命。

切片時(shí)注意動(dòng)作均勻搖動(dòng)把手，不可用力過(guò)猛，動(dòng)作輕柔，右手拿載玻片輕輕平穩(wěn)地壓組織，使其平整地吸附在載玻片上。在貼附組織時(shí)可順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶，幫助組織平展，但不可用力過(guò)猛牽拉出現(xiàn)組織變形擠壓或者空洞破碎。冰凍取片時(shí)注意一次性粘附組織片，傳統(tǒng)手法可能一張載玻片多次粘附動(dòng)作，這樣雖然粘貼組織多，但前期取片組織鏡下觀(guān)察往往易發(fā)生退變，可以利用防卷板一次性多切片，然后一起粘附。對(duì)于淋巴結(jié)懷疑有轉(zhuǎn)移者，應(yīng)連續(xù)切片間隔取片3～4張，充分顯示不同層面病變做到不遺漏。如在冰凍切片中，淋巴結(jié)組織冷凍過(guò)脆出現(xiàn)破碎小裂口，或者呈粉沫狀，解決辦法是打開(kāi)觀(guān)察窗戴薄膜手套用手將組織塊暖一下，或?qū)⒔M織取出來(lái)在室溫中停留片刻，令其迅速回暖再行切片，這樣就能切出完整連續(xù)的切片[7]，注意時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)。

切片完成后應(yīng)立即將切片放入固定液中，固定的作用是使蛋白質(zhì)變性、凝固、沉淀，保持細(xì)胞、組織原有的形態(tài)[8]，及時(shí)固定使切片細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，切忌在室溫中停留干燥再固定，否則容易造成細(xì)胞退變，喪失組織原有結(jié)構(gòu)。在室溫高或空氣干燥的情況下，室溫越高，退變速度越快[9]。固定時(shí)間要充分，至少1.5 min，固定后水洗也要充分，徹底洗去多余的固定液和包埋劑，注意這兩個(gè)時(shí)間不可省略。如冰凍取片后吹風(fēng)機(jī)吹干固定，梯度酒精脫水后吹干封片，都易導(dǎo)致細(xì)胞退變皺縮。

冰凍制片完成，再發(fā)完冰凍報(bào)告后冰凍組織塊取出流水沖洗脫離樣本托立即投入10%中性甲醛固定液中，固定組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，避免組織自溶，保存細(xì)胞抗原性不丟失，注意不可以常溫等待自然融化。冰凍組織塊在處理完冰凍報(bào)告后常規(guī)行石蠟脫水處理程序，組織學(xué)制片石蠟病理診斷驗(yàn)證術(shù)中冰凍報(bào)告。在331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢工作中，發(fā)現(xiàn)有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2 mm，冰凍制片未發(fā)現(xiàn)，考慮冰凍組織切面淺未切上，總結(jié)工作經(jīng)驗(yàn)，冰凍制片還需多切面多取片。余冰凍石蠟相吻合，冰凍與石蠟診斷符合率達(dá)99.40%。

綜上所述，制作高質(zhì)量冰凍切片，還需要規(guī)范操作，細(xì)節(jié)調(diào)整改進(jìn)，才能不斷提高冰凍切片質(zhì)量。術(shù)中冰凍切片可以可靠地評(píng)估乳腺癌患者前哨淋巴結(jié)活檢的狀態(tài)，能夠避免大多數(shù)女性的二期手術(shù)，在早期乳腺癌患者手術(shù)中使用前哨淋巴結(jié)冷凍切片及冰凍診斷為臨床制定進(jìn)一步手術(shù)方案提供了可靠依據(jù)。

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收稿日期：2019-4-27;修回日期：2019-5-20

編輯/王朵梅