胡秀卿，張昌朋，俞建忠，何紅梅，吳珉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 浙江省植物有害生物防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)是由先正達(dá)公司研發(fā)的內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，具有保護(hù)和治療雙重功效，持效期長(zhǎng)，是我國(guó)農(nóng)作物種植中使用最廣泛的殺菌劑之一。苯醚甲環(huán)唑最初主要用于瓜果和蔬菜上，但隨著國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)的增多、工藝技術(shù)水平的提高，加工劑型的豐富，使其應(yīng)用擴(kuò)展到了水稻和小麥等大田作物上[1]。至今已在36種作物上登記，其中水稻上登記數(shù)量約占20%。

苯醚甲環(huán)唑在我國(guó)作物上的大量使用，使得人們?nèi)找嬷匾暺湓谵r(nóng)產(chǎn)品上的殘留。近年來我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作已陸續(xù)開展，張志恒等[2-3]開展了果蔬中氯吡脲及稻米等農(nóng)產(chǎn)品中三唑磷的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，葉孟亮等[4]對(duì)蘋果中4種常用農(nóng)藥進(jìn)行了膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等。而苯醚甲環(huán)唑在初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品如水稻、蔬菜、水果以及加工產(chǎn)品番茄醬中的殘留及檢測(cè)方法已有報(bào)道[5-18]，為研究和了解苯醚甲環(huán)唑殘留情況提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)和手段。國(guó)內(nèi)雖已有開展對(duì)稻米中污染物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，如孫明娜等[16]對(duì)呋蟲胺在水稻中的殘留消解及膳食風(fēng)險(xiǎn)研究，宋雯等[17]對(duì)稻米鎘含量進(jìn)行調(diào)查并進(jìn)行膳食暴露評(píng)估等，但報(bào)道總體較少。張雪燕等[18]也對(duì)三七中苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行了膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但尚未見針對(duì)不同人群開展稻米中苯醚甲環(huán)唑膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究的報(bào)道。本研究開展規(guī)范殘留田間條件下稻米中苯醚甲環(huán)唑的最終殘留研究，評(píng)估糙米中苯醚甲環(huán)唑的各類人群膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)，為苯醚甲環(huán)唑在水稻上的安全合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

規(guī)范殘留田間試驗(yàn)于2013—2014年在浙江蕭山、山東淄博和廣西南寧完成。

1.1 田間試驗(yàn)

按NY/T 788—2004 《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求設(shè)計(jì)試驗(yàn)小區(qū)。試驗(yàn)設(shè)有5個(gè)處理區(qū)，有效成分分別為低高2個(gè)劑量(推薦高劑量180 g·hm-2和推薦高劑量的1.5倍270 g·hm-2)、2個(gè)施藥次數(shù)(2次和3次，施藥間隔期為7 d)以及空白對(duì)照區(qū)。每小區(qū)面積30 m2，設(shè)3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列，小區(qū)間設(shè)保護(hù)帶。施藥方式為噴霧。設(shè)最后一次施藥距收獲時(shí)間為14、21、28 d。在水稻成熟期，采集水稻稻穗樣品2 kg，脫粒、晾干、脫殼、粉碎，混勻后四分法縮分得到糙米樣品，于-20 ℃貯存待測(cè)。

1.2 主要儀器與耗材

Waters UPLC-XEVO TQ/MS高效液相色譜質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(常州市國(guó)旺儀器制造有限公司)；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；HH-4型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市江南儀器廠)；AB104-S電子天平(0.000 1 g，梅特勒公司)。

30%苯醚甲·嘧菌酯懸浮劑(浙江泰達(dá)作物科技有限公司)；98.7%苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；乙腈、甲醇(HPLC級(jí)，F(xiàn)isher科技公司)；甲酸(HPLC級(jí)，美國(guó)DIMA公司)；堿性氧化鋁(550 ℃烘4 h，5%水脫活)?，F(xiàn)裝玻璃層析柱(從下到上依次裝入少量脫脂棉、1 cm高無水硫酸鈉、5 g堿性氧化鋁、1 cm高無水硫酸鈉，輕敲至實(shí))。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g糙米樣品(精確至0.01 g)于三角瓶中，加入10 mL水、40 mL乙腈，振蕩30 min，真空抽濾。濾液轉(zhuǎn)入具塞量筒，加入8 g NaCl，劇烈振搖2 min，靜止分層。取10 mL上清液至平底燒瓶?jī)?nèi)，于40 ℃減壓濃縮至干，待凈化。

將現(xiàn)裝玻璃層析柱用10 mL石油醚預(yù)淋，棄去預(yù)淋液。用石油醚∶丙酮95∶5(體積比)15 mL分3次將樣品洗滌上樣，棄去。接著用石油醚∶丙酮85∶15(體積比)45 mL淋洗，收集全部洗脫液至平底燒瓶?jī)?nèi)，于40 ℃減壓濃縮至干，用色譜甲醇定容至5.00 mL，過0.22 μm濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS檢測(cè)條件

色譜柱：Waters acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；流速：0.25 mL·min-1；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈，梯度洗脫:0→1 min(A∶B為50∶50→A∶B為10∶90)，2→3 min(A∶B為10∶90→A∶B為50∶50)。

質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；電噴霧電離(ESI+)源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；一級(jí)錐孔電壓：40 V；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣：800 L/Hr；碰撞氣氬氣：0.15 mL·min-1；定量離子對(duì)m/z：406.10/252.00，定性離子對(duì)m/z：406.10/337.05。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以色譜甲醇為溶劑，準(zhǔn)確配制濃度為0.000 5、0.001 0、0.002 5、0.005 0、0.010 0和0.020 0 mg·L-1的苯醚甲環(huán)唑系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.3.2節(jié)檢測(cè)條件下進(jìn)行分析測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收率

依據(jù)苯醚甲環(huán)唑的最高殘留限量(MRL值)和最低檢測(cè)濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，在無目標(biāo)農(nóng)藥殘留的空白糙米樣品中的添加濃度分別為0.010、0.10、5.0 mg·kg-1，各設(shè)置5個(gè)重復(fù)。按1.3.1和1.3.2節(jié)的前處理及儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

依據(jù)所建立的方法對(duì)采集的糙米樣品中苯醚甲環(huán)唑的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用于膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。國(guó)家估算每日每人攝入量(NEDI)采用以下公式計(jì)算[19]：

NEDI=Σ(STMRi×Fi)/bw。

式中：STMRi為農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范試驗(yàn)殘留中值，mg·kg-1；Fi為一般人群某一食品的消費(fèi)量，g·d-1；bw為人群平均體重，kg。

RQ為風(fēng)險(xiǎn)商值，以NEDI與每日允許攝入量(ADI)的比值來表示。一般情況下，當(dāng)國(guó)家估算每日攝入量低于每日允許攝入量(RQ≤1)，則認(rèn)為基于推薦的最大殘留限量值的農(nóng)藥殘留不會(huì)產(chǎn)生不可接受的健康風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在以上分析條件下，苯醚甲環(huán)唑保留時(shí)間約為1.59 min，儀器的最小檢出量為5×10-13g。在0.000 5～0.02 mg·L-1苯醚甲環(huán)唑的儀器響應(yīng)值與其濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3 363 100.96X-1 286.82(r=0.99)。取糙米的空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在0.010、0.10、5.0 mg·kg-1的添加水平下，平均回收率分別為93%、104%、92%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.6%、2.0%、2.5%(n=5)。根據(jù)NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》對(duì)最低殘留濃度的定義，該方法在糙米中苯醚甲環(huán)唑的最低殘留濃度為0.010 mg·kg-1。此方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)的要求。

2.2 苯醚甲環(huán)唑在糙米中的最終殘留量

2013—2014年在浙江蕭山、山東淄博和廣西南寧三地的試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，最后一次施用30%苯醚甲·嘧菌酯懸浮劑后14、21、28 d，糙米中苯醚甲環(huán)唑殘留量分別為0.030～0.20、0.012～0.170、0.014～0.130 mg·kg-1，殘留量基本上隨著采樣間隔期的延長(zhǎng)而降低。經(jīng)計(jì)算，采收間隔為14、21、28 d時(shí)糙米中苯醚甲環(huán)唑的殘留中值(STMR)分別為0.072、0.042和0.038 mg·kg-1，殘留最大值(HR)分別為0.20、0.18和0.16 mg·kg-1。

表1 苯醚甲環(huán)唑在糙米中的最終殘留量

2.3 長(zhǎng)期膳食暴露和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

苯醚甲環(huán)唑已在我國(guó)水稻上獲得正式登記，本次評(píng)估圍繞初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品糙米來展開。末次施藥后采收間隔期14、21、28 d的苯醚甲環(huán)唑在糙米上的最終殘留試驗(yàn)STMR分別為0.072、0.042和0.038 mg·kg-1，苯醚甲環(huán)唑的ADI參考值為0.01 mg·kg-1，以調(diào)整后得到的2008年我國(guó)各類人群食物消費(fèi)量為基礎(chǔ)[3,20]，計(jì)算估計(jì)暴露量和風(fēng)險(xiǎn)商值，并用來判斷膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)不同人群(年齡和性別)中稻米的平均消費(fèi)量(F)、NEDI和苯醚甲環(huán)唑的風(fēng)險(xiǎn)商詳見表2。結(jié)果顯示，各類人群國(guó)家估計(jì)每日攝入量在0.000 167～0.000 783 mg·kg-1·bw·d-1，只占ADI的1.7%～7.8%。我國(guó)各類年齡組、不同性別人群僅來源于稻米的苯醚甲環(huán)唑風(fēng)險(xiǎn)商為0.016 7～0.078 3，表明在稻米中的苯醚甲環(huán)唑殘留對(duì)各類人群的長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)不構(gòu)成需要重點(diǎn)關(guān)注的貢獻(xiàn)。

表2 不同人群對(duì)稻米的平均消費(fèi)量及來源于稻米的苯醚甲環(huán)唑國(guó)家估計(jì)每日攝入量和風(fēng)險(xiǎn)商

3 小結(jié)與討論

近年來我國(guó)加快了農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定工作，苯醚甲環(huán)唑已經(jīng)制定了包括谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、干制水果、堅(jiān)果、糖料、飲料類、藥用植物9大類共計(jì)47種作物的限量標(biāo)準(zhǔn)[21]，其中在糙米中的MRL值為0.50 mg·kg-1。本研究中以30%苯醚甲·嘧菌酯懸浮劑在浙江、廣西、山東三地施藥2～3次，距末次施藥后14～28 d苯醚甲環(huán)唑在糙米樣品的最高殘留量為0.20 mg·kg-1；陳國(guó)峰等[5]以32.5%苯醚甲·嘧菌酯懸浮劑在哈爾濱、鄭州和南京三地，距末次施藥后15 d苯醚甲環(huán)唑在糙米中的最高殘留量為0.461 mg·kg-1；張志勇等[12]以10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑在湖南、浙江和吉林三地，距末次施藥后14 d苯醚甲環(huán)唑在糙米中的最高殘留量為0.19 mg·kg-1，均低于我國(guó)制定的限量標(biāo)準(zhǔn)。

水稻是我國(guó)重要的糧食作物，全國(guó)約有65%以上的人口以稻米為主糧。目前我國(guó)苯醚甲環(huán)唑在有效登記期內(nèi)的產(chǎn)品共有637個(gè)，其中原藥34個(gè)，單劑272個(gè)，混劑331個(gè)，其中在水稻上登記165個(gè)，為保證國(guó)民膳食安全，迫切需開展稻米中苯醚甲環(huán)唑殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究結(jié)果表明，我國(guó)各類年齡組、不同性別人群僅來源于稻米的苯醚甲環(huán)唑風(fēng)險(xiǎn)商為0.016 7～0.078 3。雖然中國(guó)不同年齡組人群食用糙米帶來的苯醚甲環(huán)唑膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低，但不同年齡組人群膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)還是存在明顯差異。

本研究數(shù)據(jù)僅來源于2年三地的水稻種植區(qū)的試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)作物分布區(qū)域指南》中水稻選擇點(diǎn)7個(gè)試驗(yàn)區(qū)域20個(gè)省份來說，評(píng)估數(shù)據(jù)量還有待增加。同時(shí)，苯醚甲環(huán)唑在我國(guó)其他作物如蔬菜水果上登記量也相當(dāng)大，本研究?jī)H考慮了糙米對(duì)我國(guó)居民健康狀況的影響，因此，苯醚甲環(huán)唑的長(zhǎng)期膳食暴露有低估的風(fēng)險(xiǎn)。從另一方面來說，本文中苯醚甲環(huán)唑的長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的膳食數(shù)據(jù)是基于2002年衛(wèi)生部進(jìn)行的中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查資料，根據(jù)我國(guó)2008年各類食物的生產(chǎn)量、進(jìn)出口量、人口數(shù)量等折算出2008年不同人群稻米消費(fèi)量。但這些年來，中國(guó)居民的膳食結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生一定的變化，稻米的消費(fèi)量可能會(huì)有所降低。這將可能抵消部分在果蔬上使用苯醚甲環(huán)唑而導(dǎo)致低估風(fēng)險(xiǎn)的可能性。