羅燕燕，劉效栓△，王紅麗，肖正國，顧秀琰，張中華，朱 平，張柏桃，臺(tái)永利

1.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部(蘭州 730050)；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院(蘭州 730070)；3.海思科醫(yī)藥集團(tuán)(成都 610000)

據(jù)估計(jì)，我國每年有數(shù)萬噸的甘草廢渣沒有被資源化利用而浪費(fèi)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草藥渣是一種寶貴的可再利用資源[2]，其中仍含有大量的黃酮[3]，而其中富含的黃酮有顯著的抑菌、抗炎、抗?jié)?、抗氧化、抗自由基、降血脂、解痙鎮(zhèn)痛等藥理活性[4-8]。

大孔吸附樹脂是自20世紀(jì)60年代興起的，可用于黃酮的分離純化，是一類普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域的有機(jī)高聚物吸附劑[9-11]。聚酰胺樹脂法則是近幾年在分離純化黃酮類物質(zhì)上有較好的應(yīng)用，具操作簡單、效率高、成本低、穩(wěn)定性好和再生簡便等優(yōu)點(diǎn)[12]。易運(yùn)紅等[13]采用5種大孔吸附樹脂ADS-7、D101、HPD-300、HPD-910和AB-8分離純化甘草黃酮，并考察了樣品濃度、洗脫劑乙醇濃度及用量等影響吸附性能的因素，得出ADS-7樹脂對(duì)黃酮類化合物有較好的吸附純化作用；張志東[14]分別選擇了AB-8、Dml30、SP825三種大孔樹脂進(jìn)行甘草黃酮的吸附和解吸，通過對(duì)三種樹脂在同一條件下的平衡濃度、吸附量、解吸率等關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，最終選用SP825大孔樹脂為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。楊少娟等[15]通過比較不同條件下聚酰胺樹脂對(duì)甘草黃酮的靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附的效果，確定了甘草黃酮分離純化的最佳條件；李俊松等[16]研究聚酰胺富集甘草中黃酮的工藝參數(shù)，最終確定最佳純化工藝條件為：甘草聚酰胺比2∶1(g/g)，樹脂徑高比1∶7，用 5倍量柱體積70%乙醇洗脫，甘草黃酮洗脫率在90%左右。

本研究通過大孔吸附樹脂ADS-7、AB-8 和聚酰胺3種吸附樹脂，靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)，及ADS-7樹脂動(dòng)態(tài)吸附解吸試驗(yàn)，優(yōu)化出了分離純化甘草總黃酮的最佳工藝，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

儀器與試藥

1 儀器 UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；AR124CN 型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；SB-3200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；ZXFD-A5140型全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；DZF-6090型減壓干燥箱(上海喬躍電子有限公司)；SHA-C水浴恒溫震蕩器(金壇市佳美儀器有限公司)；砂芯層析柱(2.1cm×30cm，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 試藥 甘草飲片(甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司批號(hào)：150922，150701，經(jīng)甘肅省藥檢院宋平順主任藥師鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fisch)、自制甘草渣(批號(hào)：150922，150701)得總黃酮提取物(批號(hào)：20160504、20160505、20160506)、甘草苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20414，純度≥98%)、ADS-7型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)、AB-8型大孔吸附樹脂(上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)、聚酰胺(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀均為分析純。

方法與結(jié)果

1 總黃酮含量測(cè)定

1.1 對(duì)照品溶液的制備：取甘草苷對(duì)照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加70 %乙醇稀釋至刻度，配制成0.830 mg/ml，搖勻即得。

1.2 供試液的制備：取總黃酮提取物(批號(hào)：20160504)適量，研細(xì)取8 g，精密稱定，置1000 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇標(biāo)定，搖勻即得。

1.3 檢測(cè)波長的確定：取對(duì)照品溶液、供試液各0.1 ml，分別加10%氫氧化鉀溶液0.1 ml，顯色5 min，用70%乙醇稀釋至5 ml，在波長800～200 nm中掃描，記錄λ值[17]，最終選擇對(duì)濃度相對(duì)穩(wěn)定的峰λmax336 nm為測(cè)定波長。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取對(duì)照品溶液2.5 ml至25 ml容量瓶中，加10%氫氧化鉀溶液2.5 ml，放置5 min，用70%的乙醇定容至刻度。精密吸取0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.2 ml置10 ml容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度；在336 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程y=64.458x-0.0048(r=0.9997)，線性范圍：4.98～9.96μg/ml。測(cè)量的吸光度值見表1。

表1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

1.5 樣品含量測(cè)定：取三批總黃酮提取物(批號(hào)：20160504，20160505，20160506)適量，精密稱定，置10 ml容量瓶中，加70 %乙醇至刻度線，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，用70 %乙醇標(biāo)定，搖勻后取0.5 ml至10 ml容量瓶，加入10 %氫氧化鉀溶液0.5 ml，顯色5 min，定容至刻度，在336 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，見表2。

表2 三批總黃酮提取物中總黃酮含量

2 吸附樹脂的篩選 以吸附率、解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選ADS-7型大孔吸附樹脂、AB-8型大孔吸附樹脂及聚酰胺吸附樹脂。計(jì)算公式如下：

Q=(C0-C1) ×V1/W (1)

E (%)=(C0-C1) /C0×100% (2)

D(%)=C2V2/[(C0-C1) ×V1]×100 % (3)

以上公式中：Q為吸附量(mg/g濕樹脂)；E為吸附率(%)；D為解吸率(%)；C0為樣品起始質(zhì)量濃度、C1為平衡液黃酮質(zhì)量濃度、 C2為解吸后料液黃酮質(zhì)量濃度(mg/ml)；V1為吸附溶液體積、V2為解吸溶液體積(ml)；W為樹脂質(zhì)量(g)。

2.1 樹脂預(yù)處理：稱取3種型號(hào)樹脂適量，分別加入3 BV 95 %乙醇放置24 h，至充分溶脹。將浸泡后的樹脂濕法加入層析柱中，以95 %乙醇沖洗至流出液加水無白色渾濁，去離子水洗脫至流出液無醇味；2～3 BV 5% 鹽酸溶液洗層析柱，并浸泡2 h，去離子水洗至中性；2～3 BV 5 % 氫氧化鈉溶液洗層析柱，并浸泡2 h，去離子水洗至中性，浸泡于95%乙醇中備用。

2.2 靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)：稱取“2.1”項(xiàng)下備用的三種樹脂各2.0 g(抽干狀態(tài))， 至250 ml 具塞錐形瓶中，分別加入25 ml“2.1”項(xiàng)下供試液(8 mg/ml)，蓋上塞子，于水浴振蕩器中振蕩24 h，測(cè)定此時(shí)溶液中總黃酮的含量，按式(1)、(2)計(jì)算吸附量(Q)和吸附率(E)。過濾掉錐形瓶內(nèi)溶液，再加入30 ml 70%的乙醇，具塞振蕩洗脫24 h，待充分解吸后，測(cè)定此時(shí)解吸液中總黃酮的含量，按式(3)計(jì)算解吸率(D)，以確定最佳吸附樹脂。

通過對(duì)三種樹脂：ADS-7、AB-8、聚酰胺進(jìn)行靜態(tài)吸附及解吸效果測(cè)定，結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，ADS-7型大孔吸附樹脂有較高的吸附率，為89.63%，但其解吸率為73.26%，略低于AB-8型大孔吸附樹脂的，考慮到AB-8型吸附率較低，而解吸率是基于吸附效果而言的，綜合考量，確定ADS-7為純化甘草黃酮的最佳樹脂。

表3 三種樹脂對(duì)樣液中總黃酮靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果

2.3 ADS-7大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

2.3.1上樣液pH對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響 取五份供試液(8mg/ml)適量，調(diào)pH分別為1、3、5、7、9，上樣量各6 BV(樹脂體積倍數(shù))、流速2 BV/h 過大孔樹脂柱，分別收集殘液并準(zhǔn)確記錄體積，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附量、吸附率，選擇最佳pH值。黃酮吸附率隨樣液pH值增大呈上升趨勢(shì)，而當(dāng)pH>7時(shí)，有所下降，原因是黃酮與樹脂的結(jié)合是以氫鍵的方式，堿性條件下，酚羥基上的氫解離成酸根離子，從而降低了與樹脂的結(jié)合[18]。同時(shí)，隨著pH 升高流出液的顏色明顯加深，原因是黃酮樣液中存在多為酚類物質(zhì)的色素，在堿性條件下色素轉(zhuǎn)化為鹽而溶于水，不易被樹脂吸收。綜合考量吸附率和色素殘留量[19]，最終選取樣液pH 值為7。上樣液不同pH對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響見表4。

2.3.2 上樣液濃度對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響：取5支層析柱，分別將濃度為7、7.5、8、8.5、9 mg/ml的總黃酮提取物溶液用5 % NaOH溶液調(diào)至pH=7，每種濃度 6 BV，以 2 BV/h 流速上樣，同上計(jì)算吸附量、吸附率，選取合適的上樣濃度。濃度為8 mg/ml時(shí)，具有較高的吸附率，從表5看出，隨著濃度升高，吸附量依次增大，但超過樹脂吸附飽和度后，樣液有所泄漏，故上樣液濃度選擇8 mg/ml為宜。吸附效果的影響見表5。

表4 五份不同樣液pH值對(duì)甘草黃酮吸附的影響

表5 五份不同樣液濃度對(duì)甘草黃酮吸附的影響

2.3.3 上樣液流速對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響：取5支層析柱，將8 mg/ml pH=7的上樣液分別以1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 BV/h 流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，每次2 h，收集流出液，計(jì)量體積，測(cè)定其中黃酮的吸光度，計(jì)算吸附率，以選取最佳上樣流速，不同上樣流速對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響見表6。上樣流速>2.5 BV/h后，黃酮吸附率明顯下降，原因是流速過快不利于吸附的進(jìn)行，樣液有泄漏；流速較慢時(shí)雖保證了黃酮在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散，進(jìn)而提高吸附率，但耗時(shí)長。最終確定上樣流速為2.5 BV/h。

2.3.4 上樣量對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響：分別取8 mg/ml pH=7的上樣液 3～7 BV，以2.5 BV/h進(jìn)行吸附試驗(yàn)，測(cè)定大孔樹脂對(duì)甘草黃酮的吸附效果，以確定最佳上樣量，不同上樣量對(duì)甘草黃酮吸附效果的影響見表7?？梢娚蠘恿?5 BV 后，吸附率趨于平穩(wěn)，增加上樣量只會(huì)浪費(fèi)成本，故選擇最佳上樣量為5 BV。

表6 五份不同上樣流速對(duì)甘草黃酮吸附的影響

表7 五份不同上樣量對(duì)甘草黃酮吸附的影響

2.3.5 洗脫劑濃度對(duì)甘草黃酮解吸效果的影響：取5份8mg/ml 5 BV樣液，分別加入 5 根樹脂柱，以2.5 BV/h流速通過后，用6 BV體積分?jǐn)?shù)50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇洗脫，解吸速率統(tǒng)一為2 BV/h，計(jì)算收集液中黃酮解吸率，解吸效果的影響見表8。黃酮解吸率隨乙醇濃度增大總體呈上升趨勢(shì)，而當(dāng)濃度為80 %時(shí)，吸附率達(dá)到最高，吸附效果最佳，因此確定80 %乙醇為解吸劑。

2.3.6 洗脫速率對(duì)甘草黃酮解吸效果的影響：取5 份 8 mg/ml的樣液5 BV，分別加入備好的樹脂柱內(nèi)，以 2.5 BV/h 流速吸附后，用6 BV體積分?jǐn)?shù) 80%乙醇以1.5、2、2.5、3、3.5 BV/h 速率洗脫，測(cè)定洗脫液中黃酮含量并計(jì)算黃酮解吸率，結(jié)果見表9。隨著洗脫速率的增加，解吸率曲線逐漸上升，而當(dāng)流速>3 BV/h后，由于解吸過快，導(dǎo)致洗脫不充分而降低解吸率，曲線反而下降。故確定3 BV/h為最佳洗脫速率。

2.3.7 洗脫劑用量對(duì)甘草黃酮解吸效果的影響：取 5 份8 mg/ml的樣液5 BV，分別上備好的樹脂柱，以 2.5 BV/h流速吸附后，用80 %乙醇，3、4、5、6、7 BV量，3 BV/h 速率洗脫，測(cè)定洗脫液中黃酮含量，計(jì)算解吸率，結(jié)果見表10。隨著洗脫劑用量的增加，黃酮解吸率先呈上升趨勢(shì)，當(dāng)>5 BV后，解吸曲線增幅較緩，洗脫量在6 BV時(shí)，解吸效果最好，再增加洗脫劑用量除了增加成本對(duì)解吸并無多大實(shí)際意義，綜合考慮解吸率和節(jié)省溶劑，確定6 BV為最佳洗脫用量。

表8 五份不同濃度洗脫劑對(duì)甘草黃酮解吸的影響

表9 五份不同洗脫速率對(duì)甘草黃酮解吸的影響

表10 五份不同洗脫劑用量對(duì)甘草黃酮解吸的影響

綜上，甘草渣中總黃酮提取物的樹脂純化工藝方法確定為：取 pH值為7，樣液濃度為8 mg/ml的甘草總黃酮供試液5 BV，以 2.5 BV/h流速上樣后，用體積分?jǐn)?shù)為80 %的乙醇溶液6 BV以3 BV/h的流速洗脫，收集洗脫液，即得。

2.4 總黃酮干燥工藝篩選：洗脫液回收乙醇后減壓濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(25 ℃)的浸膏，分別進(jìn)行常壓干燥(80 ℃)、減壓干燥(真空度<0.06 Mpa，溫度<60 ℃)、微波干燥(溫度<60 ℃，5 min)，對(duì)干燥物的性狀、溶化性定性檢查，并測(cè)定總黃酮的含量。結(jié)果見表11。

表11 干燥工藝條件的優(yōu)選結(jié)果

結(jié)果表明，微波干燥所得干燥物其性狀、溶化性、總黃酮含量均較常壓干燥、減壓干燥好，而且干燥時(shí)間短，故干燥工藝采用微波干燥法。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)：為了驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證純化工藝的合理可行，按照優(yōu)選的工藝參數(shù)將不同批次(20160504、20160505、20160506)總黃酮提取物制樣后通過預(yù)處理好的ADS-7型大孔吸附樹脂并洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(25 ℃)的浸膏，微波干燥(溫度<60 ℃，5 min)，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表12。

表12 不同批號(hào)總黃酮提取物純化效果比較(n=3)

可見ADS-7型大孔樹脂對(duì)甘草黃酮的純化效果顯著，微波干燥方法合理可行，表明優(yōu)化的工藝精制率高，穩(wěn)定可靠，具可操作性和重現(xiàn)性。

討 論

1 聚酰胺樹脂的局限性 聚酰胺吸附機(jī)理為H鍵吸附，對(duì)黃酮在酸性條件下吸附較好，但過酸的條件下不利于總黃酮的洗脫[20]。通過試驗(yàn)得出，甘草渣中總黃酮提取物所制樣液在聚酰胺樹脂上吸附效果極差，原因可能是樣液pH為5所致。雖然可通過調(diào)節(jié)樣液pH來確定聚酰胺吸附總黃酮的最佳pH及吸附率，但聚酰胺存在粉性強(qiáng)、易耗損、阻塞柱子等問題，因此該實(shí)驗(yàn)選用大孔吸附樹脂做進(jìn)一步研究。

2 檢測(cè)波長的選擇 2015年版《中國藥典》未收載甘草總黃酮含量測(cè)定方法。文獻(xiàn)報(bào)道甘草總黃酮含量測(cè)定方法眾多，而以甘草苷為對(duì)照品、氫氧化鉀為顯色劑最為推薦，但選擇的吸收波長各不相同。高紅等[21]采用紫外分光光度法測(cè)定甘草總黃酮的含量，以甘草苷為對(duì)照品，10 %氫氧化鉀為顯色劑，最大吸收波長407 nm；馮薇等[22]研究甘草總黃酮含量測(cè)定方法，甘草苷對(duì)照品及樣品溶液經(jīng)堿處理后，最大吸收波長為334 nm；本研究在預(yù)試驗(yàn)中做了大量篩選，發(fā)現(xiàn)隨著濃度不斷稀釋，對(duì)照品溶液顯色后的最大吸收波長藍(lán)移。而要控制吸光度在0.3～0.7 范圍內(nèi)，其濃度范圍比較窄(4.48～9.96 )μg/ml，最大吸收波長在336 nm 處。

3 pH對(duì)紫外吸收的影響 體系的pH對(duì)紫外吸收光譜的影響較為普遍，包括對(duì)酸性、堿性亦或中性物質(zhì)都有明顯的影響[23]。而當(dāng)前對(duì)于甘草總黃酮含量的測(cè)定普遍用紫外可見分光光度法。因此，建議在未來科學(xué)研究中，流動(dòng)注射法-化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)法、免疫化學(xué)發(fā)光等這些靈敏度高的分析檢測(cè)方法應(yīng)逐步被用于中藥總黃酮的含量測(cè)定[24]。