李明娟，呂立華，楊 林

(邵陽學院，湖南 邵陽 422000)

醌類化合物是指分子內(nèi)具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)具有較廣泛的生物活性，如殺菌、消炎、瀉下、抗病毒、抑制腫瘤生長、擴張冠狀動脈、提高機體免疫機能等[1-2]，臨床上可治療冠心病、心梗等[3]。天然的醌類生物活性物質(zhì)，亦是一大類抗腫瘤藥物，主要分布在 50 多科 100 多種高等植物的根、莖、枝、葉、果實及心材中[4]。研究天然植物中的醌類化合物，對進一步提高天然植物與藥物的利用價值具有直接指導意義。

天然菲醌(phenanthraquinone)衍生物包括鄰醌及對醌兩種類型，含菲醌類的植物分布在唇形科、蘭科、豆科、番荔枝科、使君子科、蓼科、杉科等高等植物中[5]。密花石豆蘭(Bulbophyllum odoratissimum Lindl),為蘭科植物云南石仙桃(Pholidota yunnanensis Rolfe)的干燥根狀莖和假鱗莖[6]，別名果上葉、羊奶果、極香石豆蘭、石串蓮，是土家族、苗族的民間常用藥物，對慢性咽炎，慢性氣管炎，肺結(jié)核咳嗽、咯血，瘡瘍腫痛等癥等其他慢性炎癥有較好的治療作用[7]。目前已從由植物密花石豆蘭中分出一個新型的鄰菲醌化合物石豆菲醌[8]。這類菲醌成分生理活性多樣、顯著，有抗腫瘤活性，近年來成為各國學者研究的焦點。因此，對密花石豆蘭石豆菲醌的分析，對研究密花石豆蘭的藥用部位和價值具有指導意義，為進一步開發(fā)該藥物打下基礎。本實驗采用有機溶劑超聲提取的方法提取菲醌，建立硅膠薄層色譜的鑒別方法和高效液相色譜法定量分析方法，對其含量測定進行了分析，據(jù)此亦可作為密花石豆蘭質(zhì)量控制的參考。

1 儀器和試藥

Waters2695高效液相色譜儀，含四元梯度泵、自動進樣器；萬分之一電子分析天平(Sartorius 公司)；UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；銳思捷超純水機Unique系列(南京伊若達儀器設備有限公司)；超聲波清洗器KQ3200B型(昆山市超聲儀器公司)；薄層層析所用硅膠(顆粒范圍 10～40 μm)(青島海洋化工廠)，石豆菲醌對照品(曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14032101)；甲醇為色譜純由天津科密歐化學試劑公司提供，其它試劑均為分析純；液相用水為超純水。

2 溶液的制備

2.1 對照品準溶液的配制

精密稱取五氧化二磷干燥至恒重的石豆菲醌對照品25 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解，加水至刻度，搖勻，制得對照品貯備液，精密量取貯備液1 mL置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

密花石豆蘭干燥藥材粉碎，過 60 目篩，精密稱定粉末25.0 g，加入250 mL甲醇，搖勻，精密稱定，用超聲波清洗器于40 ℃水浴中超聲提取 30 min，冷卻至室溫，加甲醇補足至原稱定重量，以6 000 r ·min-1離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即得供試品溶液[9]。

3 色譜方法建立與結(jié)果

3.1 色譜鑒別

以甲醇為溶劑，將供試品溶液稀釋配制為1 mg/mL的溶液，取供試品與標準品的甲醇溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中檢視，兩者在相應位置出現(xiàn)相同顏色斑點[10]，可確認該供試品為石豆菲醌。

3.2 色譜定量分析

3.2.1 檢測波長的選擇

為確定石豆菲醌標準品的最佳吸收波長，應用紫外-可見分光光度計在190～400 nm波長范圍內(nèi)對石豆菲醌標準溶液進行掃描[11]，發(fā)現(xiàn)其在266 nm 波長處具有最大吸收，因此，高效液相色譜檢測波長選定為266 nm。

3.2.2 色譜條件

色譜柱：以Agilent Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)為色譜柱，流動相為乙腈-水(60∶40)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為266 nm；柱溫：室溫30℃，進樣量:10 μL。在此色譜條件下獲得對照品溶液、樣品溶液的色譜圖如圖1、2所示。

圖1 石豆菲醌對照品溶液高效液相色譜圖

圖2 密花石豆蘭供試品溶液高效液相色譜圖

3.2.3 線性與范圍

按照2.1項下制得的對照品貯備液，精密量取1.0、2.0、4.0、8、10.0 mL置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。依照上述高效液相色譜法條件記錄峰面積，各進樣10μL。以石豆菲醌對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y=687958X-1215，r=0.9892，實驗表明，石豆菲醌在測定濃度為50～500μg·mL-1的范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。

3.2.4 精密度試驗

精取石豆菲醌對照品溶液，重復3天進樣，每日重復進樣5次，記錄峰面積，以測定其日內(nèi)精密度和日間精密度。計算待測峰峰面積的相對標準偏差RSD，結(jié)果，日內(nèi)精密度為0.98%和日間精密度RSD為2.12 %，說明儀器的精密度良好。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗

精取同一供試品品溶液，在配制后室溫放置0、2、4、6、12、24 h分別進樣1次，計算峰面積相對標準偏差RSD為1.13%，說明樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.2.6 重復性實驗

取同批樣品，按“2.2”項下制備供試品溶液 6 份，分別按上述的色譜條件重復進樣,每份平行測定兩次，并計算各份的石豆菲醌含量，其RSD為1.39%，重現(xiàn)性良好。說明方法的重復性良好。

3.2.7 回收率試驗

取同一批號的密花石豆蘭樣品，含量為0.0986%，按上述2.2方法制備供試品溶液按上述色譜條件分離、測定，計算回收率，結(jié)果見表1。表明方法的回收率良好，準確度較高，方法可行。

表1 加樣回收率試驗

3.2.8 樣品的含量測定及結(jié)果

取不同批次的5批密花石豆蘭，每批精密稱取2.5g各3份，按上述2.2方法制備供試品溶液并測定石豆菲醌含量。結(jié)果見表2所示。

表2 5批樣品含量測定的結(jié)果

4 討論

石豆菲醌系菲醌類化合物，是新藥開發(fā)研究中一個非常重要的資源。天然菲醌分為鄰菲醌及對菲醌兩種類型，具有菲醌母核，屬于二萜類化合物，建立天然菲醌化合物的分析方法，能對天然藥物的開發(fā)和質(zhì)量控制研究奠定基礎。目前，對密花石豆蘭菲醌類化合物的分離分析幾乎未見文獻報道，本課題經(jīng)過多次預試試驗，采用有機溶劑超聲提取的方法能較大程度地提取菲醌化合物，通過硅膠薄層色譜建立初步的鑒別方法，并探索了高效液相色譜法定量分析的條件與方法，經(jīng)過一系列的方法學考察，證明該方法操作方便，分離效果好、精密度和重現(xiàn)性高，穩(wěn)定性好；測量結(jié)果準確、可靠，能為密花石豆蘭石豆菲醌的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)，也為密花石豆蘭等其他蘭科植物的資源的開發(fā)利用提供了分析方法。