北京市藥品檢驗(yàn)所 中藥成分分析與生物評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（102206）江志杰 張光華

北京茗澤中和藥物研究有限公司（102629）李斐菲 郭青葦

氟比洛芬又稱苯氟布洛芬、氟聯(lián)苯丙酸，是一種強(qiáng)效苯丙酸類解熱抗炎鎮(zhèn)痛藥，能抑制前列腺素合成環(huán)氧合酶而起到止痛、抗炎及解熱作用。它為白色或類白色結(jié)晶性粉末，在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中易溶，在乙腈中溶解，在水中幾乎不溶[1]。它是一種新型的非甾體類鎮(zhèn)痛抗炎藥，品種有片劑、滴眼藥、緩釋膠囊劑等[2]。藥品一旦受到微生物污染，將造成藥品變質(zhì)，主要成分分解而失效，也可能分解產(chǎn)生毒素，造成機(jī)體反應(yīng)，引起疾病甚至威脅生命[3]，而原料的微生物污染情況直接影響到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。微生物檢查作為藥品安全性的重要指標(biāo)[4]，微生物計(jì)數(shù)法用來測定原輔料或藥品受污染的程度，評價產(chǎn)品的一般衛(wèi)生質(zhì)量及安全性[5]。按照《中國藥典》2015年版四部通則1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，應(yīng)對產(chǎn)品進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。中國藥典2005年版開始引入微生物檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)，通過方法適用性試驗(yàn)研究來考察其抑菌性的大小，制定適合產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查方法[7]，以保證選用方法準(zhǔn)確、可靠。本文按照《中國藥典》2015年版的操作要求及指導(dǎo)原則，對氟比洛芬微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行適用性研究，以確定適宜、有效的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備 SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（TAMATO科學(xué)株式會社）；XS1.DTXD-0.36脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；JM-B2002電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司)。

1.2 樣品 氟比洛芬（批號分別為2131701、2131702、2131703），由永光制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與培養(yǎng)基 蛋黃卵磷脂（批號：20180304）和組氨酸鹽酸鹽（批號：20180304）來源于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；聚山梨酯80（批號：1306211）、磷酸氫二鉀（批號：1405061）和磷酸二氫鉀（批號：1303011）來源于西隴化工股份有限公司；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：20171208）來源于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：20170123）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：20170711）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：20170920）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：20170810)來源于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，均在驗(yàn)證合格的滅菌程序下滅菌，培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)均符合藥典要求。

pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液：照中國藥典2015年版通則8004配制，過濾，分裝，滅菌。

緩沖液A：聚山梨脂80 30g、蛋黃卵磷脂3g、組氨酸鹽酸鹽1g、蛋白胨1g、氯化鈉4.3g、磷酸二氫鉀3.6g、磷酸氫二鈉7.2g、純化水1000ml，121度消毒15分鐘。注意：先將蛋黃卵磷脂加到聚山梨酯80中，研磨，混合，然后加入培養(yǎng)基或是混合液體中，煮沸，待完全溶解后分裝，消完毒后，帶厚手套，將底下的沉淀慢慢搖均勻，也可以放置一周后，搖勻使用。

1.4 菌種 金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]、銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]、大腸埃希菌 [CMCC(B)44102]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]均購自中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代數(shù)均為第3代。

1.5 試驗(yàn)環(huán)境 符合《中國藥典》2015年版的要求，在環(huán)境潔凈度D級下的局部潔凈度B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；微生物限度室、潔凈工作臺及生物安全柜潔凈度經(jīng)監(jiān)測符合相關(guān)要求；每次試驗(yàn)潔凈工作臺沉降菌監(jiān)測記錄均符合規(guī)定。

2 方法

2.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。

附表1 不同方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

附表2 氟比洛芬微生物計(jì)數(shù)方法適用性回收比值

附表3 中和劑對照組的回收比值

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7d，加入3ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 微生物計(jì)數(shù)法用供試液的制備 供試液①：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

供試液②：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

供試液③：取本品5g，加緩沖液A至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 菌液對照組 方法1、方法2、方法4和5：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1ml（細(xì)菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混勻，使每1ml稀釋液中含菌量小于100cfu，分別取此菌液1ml注皿，測定其每毫升的活菌數(shù)，結(jié)果為 A。方法3：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液20ml，加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1ml（細(xì)菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混勻，使每2ml稀釋液中含菌量小于100cfu，分別取此菌液2ml注皿，測定其每毫升的活菌數(shù)，結(jié)果為A。

2.3.2 供試品對照組 方法1、方法2、方法4和5：分別取取供試液①、供試液②、供試液③10ml，加入稀釋液0.1ml，取1ml注皿，分別測定供試品本底的需氧菌總數(shù)和霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果為B。方法3：取供試液③20ml，加入稀釋液0.1ml，取2ml注皿，分別測定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果為B。

2.3.3 試驗(yàn)組 方法1、方法2、方法4和5：取供試液①、供試液②、供試液③10ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml，混勻，取1ml注皿，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果為C。方法3：取供試液③20ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml，混勻，取2ml注皿，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果為C。

2.3.4 中和劑對照組 方法5：取供試液③10ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml，混勻，取1ml注皿，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果為D。上述所加菌液的體積均未不超過供試液體積的1%。已注入供試液的平皿，細(xì)菌計(jì)數(shù)傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，而方法5是傾注含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置33℃培養(yǎng)3d，逐日觀察結(jié)果；霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置25℃培養(yǎng)5d，逐日觀察結(jié)果。

2.3.5 比值計(jì)算 試驗(yàn)菌的比值=(菌落數(shù)C-菌落數(shù)B)/菌落數(shù)A；中和劑對照組的比值=菌落數(shù)D/菌落數(shù)A。

3 結(jié)果與分析

3.1 微生物計(jì)數(shù)方法適用性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從附表1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，方法1中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉的回收率均為0，說明氟比洛芬的抑菌作用很強(qiáng)，通過分析發(fā)現(xiàn)，供試液①pH值為6.0左右，偏酸性，因此后面的試驗(yàn)均采用了堿性的磷酸緩沖液作為稀釋液，考慮到樣品為非水溶性的粉末狀，為了分散均勻，稀釋液中添加了一定量的聚山梨酯80；方法2中的銅綠假單胞菌的回收率為0.2，方法3中的金黃色葡萄球菌的回收率為0，可能是供試液量增加導(dǎo)致的，均不符合藥典要求；方法4結(jié)果顯示，除銅綠假單胞菌的回收比值為0.4，其余試驗(yàn)菌株的回收比值均大于0.5，因此考慮在培養(yǎng)基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80。

3.2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性結(jié)果 氟比洛芬的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見附表2。在3次獨(dú)立的需氧菌計(jì)數(shù)方法平行試驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的回收比值分別為1.1、0.9、0.7，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.6、1.0、0.8，銅綠假單胞菌的回收比值分別為1.0、1.0、0.9，黑曲霉的回收比值分別為0.8、1.0、0.9，白色念珠菌的回收比值分別為0.9、1.0、1.3，5株需氧菌的回收比值均符合藥典規(guī)定，因此，可照此方法測定氟比洛芬的需氧菌總數(shù)。在3次獨(dú)立的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法平行試驗(yàn)中，黑曲霉的回收比值分別為0.7、0.9、0.8，白色念珠菌的回收比值分別為0.7、0.9、1.1，2株真菌的回收比值均符合藥典規(guī)定，因此，可照此方法測定氟比洛芬的霉菌和酵母菌總數(shù)。

3.3 中和劑對微生物有無毒性結(jié)果 為考察緩沖液A和培養(yǎng)基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80對微生物有無毒性，設(shè)置了中和劑對照組，從附表3中的結(jié)果來看，中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)比值均在0.8～1.5之間，符合藥典要求的0.5～2.0范圍內(nèi)。

4 討論

隨著《中國藥典》2015年版的實(shí)施，對原料及輔料的微生物限度控制也越來越嚴(yán)格[6]。而原料的微生物檢驗(yàn)方法適用性驗(yàn)證也應(yīng)符合《中國藥典》2015年版四部[7]通則1106的要求，若回收比值為0.5～2.0，方法可用于樣品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)檢查。產(chǎn)品存在抑菌性時，中國藥典2015年版強(qiáng)調(diào)的方法學(xué)適用性試驗(yàn)更顯重要性，只有采用適宜方法去除抑菌活性，才有可能檢出藥品中污染的微生物，避免檢驗(yàn)結(jié)果假陰性，從而保證微生物限度檢查方法的科學(xué)性，以有效控制藥品質(zhì)量[8]。已有許多文獻(xiàn)報道，通過各種手段消除供試品的抑菌作用，找到合理的科學(xué)的檢測方法。平皿法是非無菌制劑微生物計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)方法，具有簡單方便，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)先考慮的方法[4]。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟比洛芬的抑菌性比較強(qiáng)，而薄膜過濾法能直接徹底消除抑菌作用、計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確度高，但是不適用于非完全溶解的供試品。Tween-80 和卵磷脂常作為季銨化合物、對羥基苯甲酸等化合物的中和劑，可能會保護(hù)微生物細(xì)胞膜起到中和作用。聚山梨酯80是一種表面活性劑，可作為乳化劑和中和劑等，用于藥品的微生物限度檢查時供試液的制備，使供試液分散系統(tǒng)更具相容性。因此，選用卵磷脂和聚山梨酯80作為中和劑，采用培養(yǎng)基稀釋法，最低稀釋級取1∶200的供試液1ml 注皿，才可以消除其抑菌作用。最終確定的方法為：取本品10g，加緩沖液A至2000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。需氧菌總數(shù)測定，取1∶200的供試液1ml，注皿，平行2份，注入3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基，依法檢查（中國藥典2015年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測定，取1∶200的供試液1ml，注皿，平行20份，依法檢查（中國藥典2015年版通則1105平皿法）。