王梅林 牛精鈴 金若其 徐瑩瑩 蔡晶晶 陳群力

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，洛陽(yáng) 471023）

小G蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的單體GTP結(jié)合蛋白，分子量為20-40 kD。小G蛋白家族成員數(shù)目龐大，超過(guò)150多個(gè)，根據(jù)其序列結(jié)構(gòu)特征，可被分為5個(gè)主要的亞家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran［1-2］。RhoB基因?qū)儆赗ho亞家族，該亞家族蛋白在細(xì)胞骨架重組、基因表達(dá)及細(xì)胞周期等的調(diào)控中起到重要作用［3］。

RhoB與其同家族成員RhoA和RhoC的氨基酸序列同源性高達(dá)86%，生物學(xué)功能也有重合，如RhoA、RhoB和RhoC協(xié)同調(diào)控細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)［4-5］，但更多的證據(jù)顯示，RhoB具有許多獨(dú)特于RhoA和RhoC的性質(zhì)和功能。例如，RhoA和RhoC在細(xì)胞中為組成性表達(dá)，而RhoB則表現(xiàn)為誘導(dǎo)型表達(dá)［6］?？拱┧幬锾幚恚ㄈ珥樸K、洛伐他?。⒆贤饩€照射、EGF或PDGF刺激等均可使RhoB的表達(dá)水平迅速上調(diào)［7-11］。又如RhoA和RhoC均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而RhoB具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能［12-13］。

RhoB在不同癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出截然不同的功能。例如，在惡性膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等腫瘤中的相關(guān)研究顯示，其具有原癌基因的功能，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或遷移［14-16］。而在腎細(xì)胞癌和胰腺癌等癌癥中，RhoB表現(xiàn)出抑癌基因的性質(zhì)，其蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)［17-18］。因此，深入研究RhoB蛋白的生理功能尤其是在癌癥發(fā)展進(jìn)程中的功能具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)旨在擴(kuò)增人RhoB基因的ORF序列，構(gòu)建獲得真核表達(dá)質(zhì)粒Flag-RhoB，并研究所構(gòu)建質(zhì)粒在真核細(xì)胞的表達(dá)情況和細(xì)胞亞定位，旨為進(jìn)一步研究RhoB蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人乳腺癌MCF7細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞、結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞、水貂肺上皮細(xì)胞Mv.1.Lu細(xì)胞、菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pCMV5作者實(shí)驗(yàn)室保存并改造，在多克隆位點(diǎn)前插入了Flag標(biāo)簽的編碼序列。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒、PrimeScrip Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑，TaKaRa公司；1 kb plus DNA ladder，天根公司；pfuDNA聚合酶、dNTP、SalⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶、標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker，F(xiàn)ermentas公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）、Flag M2抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG和Alexa FluorR 488標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAPI，Sigma公司；Lipofectamine 3000，Texas red-phalloidin，Thermo Fisher公司；酵母粉、蛋白胨和ECL顯色液，廈門(mén)鷺隆生物科技有限公司；氨芐青霉素、Trypsin以及其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海生工。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀、核酸電泳儀、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+ 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，Bio-Rad；CO2培養(yǎng)箱、制冰機(jī)、-80℃冰箱，SANYO；GSD-8000成像及分析系統(tǒng)，美國(guó)UVP；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、微量臺(tái)式高速離心機(jī)，Thermo Fisher；氣浴恒溫振蕩器，金壇市迅生儀器廠，A1R/A1激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人HEK-293T細(xì)胞總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 培養(yǎng)在6孔板匯合度為90%的HEK-293T細(xì)胞，1×PBS洗一次；加入0.5 mL的RNAiso Plus，輕輕搖勻，然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落；轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸至裂解液中無(wú)明顯沉淀，室溫靜置5 min。加入氯仿0.1 mL，蓋緊離心管蓋，用手劇烈震蕩15 s，待溶液充分乳化無(wú)分相現(xiàn)象后，再室溫靜置5 min。12 000 r/min 低溫離心15 min。吸取上清液0.15 mL，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管混勻，在室溫靜置10 min。12 000 r/min 低溫離心10 min。取出試管后小心棄去上清，緩慢的沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 r/min 低溫離心5 min后小心棄去乙醇。開(kāi)蓋室溫干燥沉淀3 min，加入20 μL RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后直接反轉(zhuǎn)錄。

cDNA第一鏈的合成過(guò)程如下。在PCR管中首先配置下列反應(yīng)混合液：Oligo dT引物 2 μL，dNTP混 合 物（10 mmol/L）2 μL，RNA 2 μL，RNase free水 4 μL。65℃ 變性5 min后，冰上迅速冷卻。簡(jiǎn)短離心后，繼續(xù)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述變性后反應(yīng)液 10 μL，5×PrimeScriptTMⅡ緩沖液 4 μL，RNase 抑制劑 0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，RNase free 水 4.5 μL。緩慢混勻后簡(jiǎn)短離心。42℃ 逆轉(zhuǎn)錄30 min。70℃ 酶滅活15 min后冰上冷卻待用。

1.2.2 獲得RhoB基因片段 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得人RhoB基因的mRNA序列，DNAMAN軟件對(duì)該序列進(jìn)行限制性酶切圖譜分析，設(shè)計(jì)引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所設(shè)計(jì)的上游引物序列為5'-GCCGGGTCGACAAGCGGCCA TCCGCAAGA AGC -3'，包含限制性內(nèi)切酶SalⅠ的識(shí)別位點(diǎn)；下游引物序列為5'-GCGTCTAGA TTATAGCACCTTGCAGCAGTTGA -3'，包含限制性內(nèi)切酶XbaI的識(shí)別位點(diǎn)。培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞，收集并提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴(kuò)增RhoB基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。割膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，用于后續(xù)連接。

1.2.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒Flag-RhoB的構(gòu)建及雙酶切鑒定 將PCR產(chǎn)物純化以利于后續(xù)酶切。純化方法為 ：取 45 μL PCR 產(chǎn)物加入 5 μL NaAc（3 mol/L）和100 μL無(wú)水乙醇，混勻后-20℃沉淀1 h；沉淀后離心，12 000 r/min 10 min；棄上清，沉淀用70%無(wú)水乙醇洗2次，35 μL無(wú)菌水溶解沉淀備用。

取 15 μL 回收的 PCR 產(chǎn)物和 1 μg pCMV5空載體用SalⅠ、XbaⅠ雙酶切，37℃，3 h。酶切體系如 下 ：SalⅠ 0.5 μL，XbaⅠ 0.5 μL，10×buffer 4μL，加入PCR產(chǎn)物或空載體后用水補(bǔ)至40 μL。

酶切后電泳回收，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接（16℃，6 h），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α涂布于LB平板，平板含有氨芐青霉素（Amp+）。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆，牙簽法小提質(zhì)粒并用雙酶切篩選符合預(yù)期的克隆。將符合預(yù)期的克隆再次轉(zhuǎn)化DH5α挑單克隆培養(yǎng)后用堿裂解法提質(zhì)粒，用SalⅠ和XbaⅠ再次雙酶切檢測(cè)，檢測(cè)符合預(yù)期的重組子送南京金斯特生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4Flag-RhoB表達(dá)產(chǎn)物的Western Blotting鑒定 將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染密度為70%的乳腺癌MCF7細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞或結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定濃度，取25 mg蛋白進(jìn)行Western Blotting分析。用12%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)膜（PVDF膜，400 mA，1.5 h）。5%的BSA室溫封閉30 min；5% BSA配制的Flag一抗室溫孵育1 h；TBST buffer洗3次，每次5 min；1% BSA配制的二抗室溫孵育1 h；TBST buffer洗3次，每次5 min；加入ECL顯色液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.5 Flag-RhoB表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光分析 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放入潔凈蓋玻片，接種Mv.1.Lu細(xì)胞，接種密度為5×104/孔，培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24h后PBS洗2遍，4%的多聚甲醛室溫固定15 min；PBS洗2遍，0.25% Triton X-100室溫通透5 min；PBS洗2遍，5%的BSA室溫封閉30 min；Flag抗體按1∶200稀釋，室溫孵育2 h；PBS洗4遍，避光條件下，Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔二抗室溫孵育1 h；PBS洗4遍，5 μg/mL Phalloidin（使用前用PBS新鮮配置）室溫孵育30 min；PBS洗4遍，避光條件下，1 μg/mL DAPI（使用前用PBS新鮮配置）室溫孵育5 min；PBS洗兩遍，封片，鏡檢。RhoB蛋白的表達(dá)用Flag抗體檢測(cè)，人IgG作陰性對(duì)照，Phalloidin染色顯示細(xì)胞骨架，DAPI染色顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 人HEK-293T細(xì)胞cDNA的合成

提取HEK-293T細(xì)胞總RNA，電泳結(jié)果（圖1）顯示成功獲得高純度的總RNA。使用PrimeScripⅡ 1st Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備人HEK-293T細(xì)胞cDNA。

圖1 人HEK-293T細(xì)胞總RNA的提取

2.2 RhoB基因的擴(kuò)增

以制備好的cDNA為模板，以設(shè)計(jì)好的引物PCR擴(kuò)增RhoB基因，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出的片段大小約為590 bp，大小符合預(yù)期（圖2）。

圖2 RhoB基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒Flag-RhoB的構(gòu)建和酶切鑒定

用SalⅠ和XbaⅠ同時(shí)將擴(kuò)增獲得的目的片段和pCMV5空載體酶切處理，膠回收后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示，雙酶切后的載體和片段大小分別為4.8 kb（載體）和590 bp（目的片段），符合預(yù)期。測(cè)序結(jié)果顯示連入的RhoB基因與GenBank上的序列完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒SalⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定圖

2.4 Western Blotting檢測(cè)重組質(zhì)粒Flag-RhoB表達(dá)情況

將空載體和重組質(zhì)粒Flag-RhoB分別轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或HCT116細(xì)胞進(jìn)行Western Blotting分析。結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的樣品中檢測(cè)到大小約為25 kD的蛋白條帶，而轉(zhuǎn)染了空載體的對(duì)照組無(wú)任何信號(hào)。說(shuō)明插入載體的RhoB基因成功表達(dá)，且表達(dá)良好。

圖4 重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)

2.5 免疫熒光檢測(cè)重組質(zhì)粒Flag-RhoB表達(dá)情況

將重組質(zhì)粒Flag-RhoB轉(zhuǎn)染Mv.1.Lu細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)初步分析RhoB蛋白在Mv.1.Lu細(xì)胞中的定位情況。免疫熒光結(jié)果（圖5）顯示，F(xiàn)lag抗體可以檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明重組質(zhì)粒表達(dá)良好。結(jié)果顯示RhoB在細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞膜上，少量定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖5 免疫熒光檢測(cè)RhoB在細(xì)胞中的定位

3 討論

盡管RhoB在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出兩面性［4］，但筆者認(rèn)為更多的數(shù)據(jù)支持RhoB抑癌基因的特性。例如，Calvayrac等［19］研究發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子p27Kip1通過(guò)結(jié)合并抑制RhoB蛋白的活性促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。Zou等［20］報(bào)道過(guò)表達(dá)RhoB通過(guò)上調(diào)PP2A的表達(dá)水平導(dǎo)致AKT1的去磷酸化失活，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

另有文獻(xiàn)報(bào)道，敲低內(nèi)源的RhoB后，人胃癌細(xì)胞NUGC-3對(duì)抗癌藥物表現(xiàn)出明顯的藥物不敏感性［21］，人咽喉癌細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)順鉑的抗藥性［22］。這些研究表明某些癌癥在治療過(guò)程中出現(xiàn)的抗藥性很可能是由于RhoB表達(dá)量下調(diào)引起的，提示可以在癌癥治療過(guò)程中人為提高RhoB的表達(dá)量或者以RhoB為靶點(diǎn)篩選合適的抗癌藥物。因此，深入闡明RhoB活性調(diào)控方式或者鑒定新的RhoB特異性效應(yīng)因子有可能為癌癥提供有效的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)構(gòu)建了上游帶有Flag標(biāo)簽的RhoB真核表達(dá)質(zhì)粒，可以方便開(kāi)展有關(guān)RhoB的功能研究。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和HCT116細(xì)胞，Western blotting結(jié)果表明該質(zhì)粒在細(xì)胞中可以順利表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以幫助判斷過(guò)表達(dá)的RhoB在細(xì)胞中的亞定位，結(jié)果顯示其主要定位于細(xì)胞膜上，胞質(zhì)和胞核中也有少量分布。

在該質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程時(shí)，RhoB基因的3'端選擇的是限制性內(nèi)切酶XbaI。該酶的識(shí)別序列為T(mén)CTAGA，與RhoB基因的終止密碼子TGA相連會(huì)產(chǎn)生一段TGATCTAGA序列。這段序列中含有GATC序列，所以需要考慮到原核生物Dam甲基化的問(wèn)題。所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)，將RhoB的終止密碼子替換成了TAA，以避免GATC序列的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度為590 bp的RhoB基因的ORF序列，并成功將其連入真核表達(dá)載體pCMV5。將重組真核表達(dá)質(zhì)粒Flag-RhoB轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠表達(dá)出大小為25 kD的蛋白。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到RhoB在細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞膜上。