張伊麗 劉照平 陸敏依 蔡明勇 吳根鵬

（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，上海 201108）

生物制品的質(zhì)量控制不僅是對(duì)終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，而且是對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過程的連續(xù)監(jiān)控，包括原材料、中間品和制檢過程的質(zhì)控。細(xì)胞基質(zhì)作為病毒性疫苗生產(chǎn)過程中必不可少的原材料，其狀態(tài)優(yōu)劣直接影響疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。MRC-5細(xì)胞是人胚肺成纖維細(xì)胞，可進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，對(duì)多類病毒敏感［1］。自建株以來用于多種病毒性疫苗的生產(chǎn)和檢定，得到了良好的安全性驗(yàn)證，如水痘疫苗［2］、帶狀皰疹疫苗［3］、甲肝疫苗［4］及狂犬疫苗［5］。但MRC-5作為二倍體細(xì)胞，具有一定的傳代壽命，超過一定代次細(xì)胞衰老，與傳代細(xì)胞相比難以大規(guī)模生產(chǎn)。因此提高細(xì)胞狀態(tài)和使用代次對(duì)該細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響極大。對(duì)于已建株的細(xì)胞系，很多工作都是圍繞優(yōu)化培養(yǎng)而開展［6-9］。pH是細(xì)胞培養(yǎng)過程中一個(gè)重要參數(shù)，并且不同細(xì)胞株有不同的pH適應(yīng)范圍［10-13］。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)方式不同，懸浮培養(yǎng)（包括懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)）使用反應(yīng)器控制pH更為精確和容易，在一定范圍內(nèi)的pH波動(dòng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生太大影響［14-16］。而貼壁細(xì)胞有較多的方瓶、轉(zhuǎn)瓶和細(xì)胞工廠靜置培養(yǎng)方式，此類容器pH可控性差，在pH條件的優(yōu)化研究中更多體現(xiàn)在培養(yǎng)起始階段［6，17-19］，對(duì)培養(yǎng)過程中pH動(dòng)態(tài)變化及對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響研究較少。

目前較市售應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)基多添加NaHCO3作為緩沖鹽，匹配合適的CO2濃度組成pH緩沖對(duì)體系。空氣中CO2分壓會(huì)影響培養(yǎng)液pH的穩(wěn)定性。特別是在開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞或進(jìn)行高濃度的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)，需要使用CO2培養(yǎng)箱以保證足夠的CO2分壓。本實(shí)驗(yàn)以NaHCO3調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基pH值，并在pH 7.2-7.6范圍配合CO2使用情況，對(duì)MRC-5細(xì)胞連續(xù)傳代過程中的細(xì)胞狀態(tài)、工作代次和病毒敏感性進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在提高M(jìn)RC-5細(xì)胞連續(xù)傳代水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MRC-5細(xì)胞（ATCC）由本公司疫苗生產(chǎn)部提供建庫，代次為27代，濃度為5.0×106個(gè)/mL。水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）毒種，由本公司疫苗生產(chǎn)部提供，代次為32代，滴度約為5.0 Lg PFU/mL。

1.1.2 主要試劑 MEM干粉、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購(gòu)自Gibco公司；NaHCO3購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；臺(tái)盼藍(lán)溶液購(gòu)自碧云天生物；EDTA細(xì)胞消化液、病毒穩(wěn)定劑由本公司疫苗生產(chǎn)部提供。

1.2 方法

1.2.1 配制細(xì)胞培養(yǎng)液 MEM干粉按照使用說明書溶解后過濾除菌，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基備用。按照質(zhì)量體積比配制5% NaHCO3母液，過濾除菌備用。配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)，使用5%NaHCO3母液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH，添加胎牛血清10%-15%，抗生素1%。

1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出1支凍存的MRC-5細(xì)胞，確認(rèn)批號(hào)、代次、濃度，迅速在38±1℃水浴中融化，復(fù)蘇至T225一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕微搖勻，置37℃，5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3-4 d至細(xì)胞生長(zhǎng)成片。

1.2.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)胞生長(zhǎng)成片后進(jìn)行傳代。吸去原細(xì)胞培養(yǎng)液，添加0.25%胰酶5-10 mL消化1-2 min。加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，按照1∶4傳代比率分裝細(xì)胞懸液至若干T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

約4-5 h細(xì)胞貼壁后，更換不同NaHCO3濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基，并對(duì)瓶蓋進(jìn)行封閉式（對(duì)照組，CO2氣體不能進(jìn)入細(xì)胞瓶）和開放式（試驗(yàn)組，CO2氣體可以進(jìn)入細(xì)胞瓶）處理。在繼續(xù)培養(yǎng)過程中，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)基pH測(cè)定并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長(zhǎng)密度。每組保留1-2瓶，固定使用同一NaHCO3濃度的培養(yǎng)液和通氣處理方式連續(xù)傳代，并在細(xì)胞收獲數(shù)較低（＜0.2×105個(gè)/cm2）達(dá)不到傳代要求時(shí)停止實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞監(jiān)測(cè) 每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、增殖速度等，并拍照記錄。在每一次傳代的同時(shí)統(tǒng)計(jì)收獲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率。

1.2.5 病毒接種及收獲 取VZV毒種按照MOI=0.001-0.01接種生長(zhǎng)成片的31代細(xì)胞，換液后連續(xù)培養(yǎng)2-3 d，待病變率達(dá)到35%-90%，使用EDTA消化病變細(xì)胞，1 800 r/min離心10 min，使用穩(wěn)定劑重懸，-70℃凍存?zhèn)溆?，進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.2.6 病毒滴定 以蝕斑法測(cè)定病毒滴度。取凍存的病變細(xì)胞，在冷凍和37±1℃條件下反復(fù)凍融3-4次，鏡檢觀察細(xì)胞完整率≤20%。1 800 r/min×10 min離心取上清，對(duì)上清液進(jìn)行500倍和1 000倍稀釋。取預(yù)先鋪滿MRC-5細(xì)胞的6孔板，每孔接種病毒上清稀釋液100 μL，吸附90 min后添加細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)每孔蝕斑數(shù)。

n：每孔蝕斑數(shù)（平均值）；D：稀釋倍數(shù)；V：每孔接種體積。

2 結(jié)果

添加不同比例NaHCO3母液（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%）調(diào)節(jié)MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH，配制后的完全培養(yǎng)液起始pH值為7.3-7.7。在2.0%和3.0%添加比例時(shí)pH分別為7.3和7.5，選擇此兩種濃度設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，觀察CO2的使用對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液pH穩(wěn)定性以及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響。

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液pH穩(wěn)定性的影響

以2.0%封閉培養(yǎng)作為對(duì)照組，3%試驗(yàn)組同時(shí)設(shè)計(jì)封閉培養(yǎng)和開放培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)31代次細(xì)胞培養(yǎng)過程中的pH變化情況并統(tǒng)計(jì)。圖1顯示封閉培養(yǎng)的2%和3%兩組細(xì)胞在培養(yǎng)2 h后pH即發(fā)生急速升高，在8-30 h內(nèi)達(dá)到最高，2.0%組約7.7，3.0%組約8.0，此時(shí)培養(yǎng)液呈深紅偏紫色。隨后，pH開始下降，在96 h后2.0%組下降至7.2-6.8，3.0%組下降至7.3-7.1。此時(shí)培養(yǎng)基呈紅偏黃色。而開放培養(yǎng)的3%組細(xì)胞培養(yǎng)液則相對(duì)穩(wěn)定，在連續(xù)144 h的培養(yǎng)過程中最高為7.5，最低為7.2，培養(yǎng)液顏色呈紅偏棕黃色。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的影響

鏡檢觀察31代細(xì)胞狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線。3組細(xì)胞在早期貼附、爬壁階段（24-48 h）生長(zhǎng)增殖相近，均可正常貼壁增殖，形態(tài)清晰呈典型纖維狀。但在72 h匯合率開始體現(xiàn)出差異，3%開放組細(xì)胞排列成形，至96 h已有80%以上的匯合率。而封閉培養(yǎng)的細(xì)胞則增殖緩慢，細(xì)胞折光性強(qiáng)，3%組在培養(yǎng)120 h后仍未能成片（圖2）。通過31代細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線也可以看出，開放培養(yǎng)的細(xì)胞從延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)期明顯快于封閉組（圖3）。

圖2 31代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

圖3 31代細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線

傳代早期細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)尚無明顯差異，細(xì)胞形態(tài)清晰呈典型纖維狀，成片后細(xì)胞排列整齊，匯合率90%以上，收獲細(xì)胞數(shù)在（0.5-0.7）×105個(gè)/cm2。連續(xù)傳代至31代后3組細(xì)胞收獲密度均開始下滑，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活率開始體現(xiàn)出差異。封閉培養(yǎng)細(xì)胞折光性增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒性內(nèi)涵物逐漸增多，細(xì)胞排列散亂，生長(zhǎng)增殖速度和細(xì)胞活率急劇下降，至35-37代已不能成片，收獲細(xì)胞數(shù)低于閾值，達(dá)不到繼續(xù)傳代要求，見圖4。開放培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)仍保持纖維狀排列，細(xì)胞活率維持在80%以上，細(xì)胞狀態(tài)下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢，可連續(xù)傳代至41代。

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞產(chǎn)毒影響

取31代細(xì)胞接種VZV病毒，觀察病毒敏感性并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)毒滴度。封閉培養(yǎng)細(xì)胞接毒后24 h細(xì)胞有圓縮、腫大、折光性增強(qiáng)，48 h局部融合病變，病變率約為60%-80%（圖5）。收獲病變細(xì)胞后采用反復(fù)凍融法釋放病毒，噬斑法檢測(cè)病毒滴度分別為4.67 Lg PFU/mL和4.60 Lg PFU/mL。開放組細(xì)胞病變與封閉組相似，產(chǎn)毒滴度略高約為4.83 Lg PFU/mL，但差異不顯著（圖6，P=0.13＞0.05）。

圖4 連續(xù)傳代細(xì)胞收獲密度和細(xì)胞活率

圖5 MRC-5細(xì)胞接種VZV病變形態(tài)

圖6 MRC-5細(xì)胞接種VZV產(chǎn)毒滴度

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)基除提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)成分外，還負(fù)責(zé)維持適宜的理化環(huán)境，如pH穩(wěn)定。培養(yǎng)基一般通過添加碳酸氫鹽或其他有機(jī)緩沖鹽（如HEPES），穩(wěn)定培養(yǎng)過程中pH變化在一個(gè)合理范圍。在采用碳酸氫鈉作為緩沖時(shí)，培養(yǎng)液pH值取決于碳酸氫根（HCO3-）和溶解態(tài)CO2濃度之間的精密平衡。若無CO2外環(huán)境或CO2分壓不足，HCO3-水解反應(yīng)平衡式右移，導(dǎo)致pH快速升高。而在培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞代謝副產(chǎn)物，如乳酸逐漸累積增多，pH才會(huì)緩慢下降。這種pH值的較大起伏變化是細(xì)胞生長(zhǎng)的不利因素。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中的pH變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。從pH變化曲線和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出，不恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式使得碳酸氫根被過度水解消耗，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液pH培養(yǎng)2 h就會(huì)急劇升高，并維持至30 h左右。此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)正處于延滯期，細(xì)胞行為處于貼附、爬壁過程中，過高的pH環(huán)境會(huì)造成細(xì)胞貼壁率低，細(xì)胞受損等。而在2-3 d（約48 h）后，隨著細(xì)胞增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞代謝加快，密度升高，細(xì)胞產(chǎn)酸增多，pH開始回落。但碳酸氫根濃度過低，已無法起到緩沖效果，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH持續(xù)走低。pH大幅波動(dòng)不僅對(duì)單代次細(xì)胞生長(zhǎng)造成損傷，而且這種損傷還可能累積影響整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)周期。高代次的封閉組細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)含物、顆粒性物質(zhì)增多，細(xì)胞活率下降明顯。而開放組細(xì)胞仍能保持胞質(zhì)均勻清晰，細(xì)胞骨架排列整齊，并維持較高的細(xì)胞活率，可連續(xù)傳代至41代。兩組細(xì)胞接種VZV測(cè)試產(chǎn)毒效果，開放組細(xì)胞產(chǎn)毒滴度略高于封閉組。綜上驗(yàn)證了穩(wěn)定的pH環(huán)境對(duì)細(xì)胞代次和狀態(tài)具有重要的影響，并且這種影響會(huì)在連續(xù)的傳代培養(yǎng)中得到累積體現(xiàn)。

疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)通常包括原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和連續(xù)傳代細(xì)胞。MRC-5屬于人類同源性二倍體細(xì)胞系，與原代細(xì)胞相比，可建立種子庫系統(tǒng)進(jìn)行充分鑒定和標(biāo)準(zhǔn)化，利于質(zhì)量控制；與連續(xù)傳代細(xì)胞相比，理論上不存在致腫瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)［20］。但MRC-5由于傳代壽命的限制，難以大規(guī)模生產(chǎn)。為突破工作代次，提升細(xì)胞狀態(tài)，可添加輔助成分進(jìn)行優(yōu)化研究［21-22］，但由此可能帶來引入外源因子的風(fēng)險(xiǎn)以及產(chǎn)品安全性風(fēng)險(xiǎn)。因此為提高細(xì)胞狀態(tài)選擇合適的培養(yǎng)優(yōu)化方式具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)僅通過調(diào)節(jié)NaHCO3濃度配合CO2分壓的使用，顯著提高了MRC-5細(xì)胞狀態(tài)和連續(xù)傳代能力，在使用方瓶、或放量應(yīng)用細(xì)胞工廠、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞時(shí)，為其優(yōu)化應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

通過監(jiān)測(cè)貼壁細(xì)胞MRC-5靜置培養(yǎng)過程中的pH動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)不恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在延滯期和對(duì)數(shù)期早期受到損傷，并且這種損傷會(huì)在連續(xù)的傳代培養(yǎng)中積累。而通過調(diào)節(jié)NaHCO3濃度與CO2分壓的使用，可以明顯提高M(jìn)RC-5細(xì)胞狀態(tài)和連續(xù)傳代能力。