實(shí)時無標(biāo)記腫瘤細(xì)胞凋亡篩選技術(shù)體系的建立

李艷偉 宋興輝 王佳佳 劉麗 黃瑩瑩 郭春

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)平臺，杭州 310058）

細(xì)胞凋亡（Apoptosis），又稱程序性細(xì)胞死亡（Pragrammed cell death），是指在一定的生理和病理情況下，機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定并由基因控制的有序的細(xì)胞自主性死亡形式［1-3］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，是研究藥物抗腫瘤作用機(jī)制的重要方向［4］。細(xì)胞凋亡檢測對于基礎(chǔ)研究和臨床診斷具有重要意義，目前用于體外細(xì)胞凋亡檢測的方法很多，流式細(xì)胞分析法可對單個細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析，是定量檢測細(xì)胞凋亡的重要方法之一，其中Annexin V/PI 法是目前較為流行的檢測細(xì)胞凋亡的方法，具有分析細(xì)胞量大、靈敏度高、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)［5-7］。

高通量實(shí)時細(xì)胞功能分析系統(tǒng)（xCELLigence-RTCA系統(tǒng)）是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細(xì)胞生理狀態(tài)的新型細(xì)胞分析系統(tǒng)，測定的電阻抗轉(zhuǎn)化為細(xì)胞指數(shù)（Cell index）即反映了細(xì)胞群體各種生理變化包括細(xì)胞生長、形態(tài)變化、死亡等一系列生理狀態(tài)［8-9］。可在近似生理環(huán)境下實(shí)現(xiàn)高通量、動態(tài)、無標(biāo)記檢測腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等多項(xiàng)生理學(xué)功能［10］。

本研究將xCELLigence-RTCA的實(shí)時無標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，選擇非小肺癌細(xì)胞A549作為靶細(xì)胞，以能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡DDP作為靶分子，采用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞分析技術(shù)作為平行對照，初步確定了這種實(shí)時無標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)的篩選體系用于腫瘤細(xì)胞凋亡篩選可行性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫ATCC：Cat No：CCL-185TM）。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶（Gibco）；青鏈霉素（Invitrogen）；胰酶購自（杭州科易生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）（Sigma）；順鉑（cis-Dichlorodiamineplatinum（II），DDP）（ 阿拉?。籄nnexin V-FITC/PI apoptosis kit（AP101）（聯(lián)科生物）。

1.1.3 儀器設(shè)備 高通量實(shí)時細(xì)胞功能分析系統(tǒng)（xCELLigence-RTCA） 及 E-Plate96孔板（ 杭州艾森生物有限公司）；多色流式細(xì)胞分析儀（BD LSRFortessa）；5% CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Cytoperm）；倒置熒光顯微鏡（OLYMBUS CKX31）。

1.2 方法

1.2.1 建立濃度梯度依賴性細(xì)胞動力學(xué)模型并確定給藥細(xì)胞濃度 取凍存的人非小肺癌細(xì)胞株A549一管，37℃快速溶解后，加入到培養(yǎng)皿中（已含10 mL培養(yǎng)基），混勻后，置于37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。選取處于指數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，吸取10 μL細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)1∶1混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，配制成終濃度分別為20 000 cells/mL、10 000 cells/mL、5 000 cells/mL、3 000 cells/mL、1 500 cells/mL的細(xì)胞懸液。

向E-Plate中加50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測培養(yǎng)液基線，將100 μL細(xì)胞懸液加入E-Plate，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，室溫靜置30 min后放入Station，15 min進(jìn)行一次CI值的測試，連續(xù)測試24 h，以細(xì)胞CI值為Y軸，以時間為X軸繪制A549細(xì)胞生長曲線。

選取同上濃度的A549細(xì)胞分別于0 h、24 h進(jìn)行顯微成像，觀察不同濃度細(xì)胞的增殖情況，結(jié)合細(xì)胞指數(shù)特征，確定適合藥物作用的細(xì)胞濃度。

xCELLigence-RTCA系統(tǒng)基于微電子阻抗變化監(jiān)測細(xì)胞活性，用細(xì)胞指數(shù)CI表示，公式如下：

Rb（f）和Rcell（f）分別代表無細(xì)胞黏附的電阻抗和有細(xì)胞黏附的電阻抗，N代表檢測到電阻抗的頻點(diǎn)數(shù)量［11］。細(xì)胞鋪板24 h內(nèi)，經(jīng)過懸浮、貼壁、潛伏期、增殖并達(dá)到覆蓋率為70%-80%的最佳指數(shù)生長期，此時細(xì)胞指數(shù)處于0.5-1范圍內(nèi)，表示該濃度細(xì)胞適合后續(xù)的功能性實(shí)驗(yàn)研究［12］。

1.2.2 xCELLigence-RTCA系統(tǒng)檢測不同濃度順鉑對A549細(xì)胞增殖的影響 選取指數(shù)生長期的A549細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照xCELLigence-RTCA系統(tǒng)監(jiān)測確定的細(xì)胞密度接種于E-Plate 96細(xì)胞檢測板中，每15 min測定一個點(diǎn)，培養(yǎng)26 h后分別加入終濃度為0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL的順鉑處理細(xì)胞。對照組不予順鉑處理，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)動態(tài)監(jiān)測96 h，每5 min記錄1次。以時間為X軸，歸一細(xì)胞指數(shù)（Normalized cell index，NCI）值為Y軸繪制藥物與細(xì)胞的時間/藥物濃度依賴曲線圖譜，觀察不同濃度順鉑對A549細(xì)胞增殖的影響，確定順鉑作用的最佳檢測時間點(diǎn)和時間依賴性IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 選取指數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照xCELLigence-RTCA系統(tǒng)監(jiān)測確定的細(xì)胞密度接種6孔板（2.5 mL）中，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)26 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（不予順鉑處理）、順鉑處理組，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。根據(jù)xCELLigence-RTCA檢測的藥物與細(xì)胞的時間/藥物濃度依賴曲線圖譜，選取凋亡曲線出現(xiàn)下降時間點(diǎn)、凋亡檢測中間點(diǎn)、凋亡檢測終點(diǎn)收集細(xì)胞，制備密度為1×106cells/mL的細(xì)胞懸液，取1 mL于4℃條件下300×g離心15 min，除去上清液，加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL重懸，再先后加入Annexin V-FITC 5 μL 和碘化丙啶染色液 10 μL，在室溫下避光孵育10 min后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立濃度梯度依賴性細(xì)胞動力學(xué)模型并確定給藥細(xì)胞濃度。

圖1是xCELLigence-RTCA系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測24 h的A549細(xì)胞濃度依賴性生長曲線模型。從中發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測24 h，不同濃度的A549細(xì)胞指數(shù)（CI值）保持繼續(xù)增長趨勢，除1 500 cells/mL濃度的A549細(xì)胞指數(shù)CI值小于0.5外，其他濃度的A549細(xì)胞指數(shù)CI值均大于0.5。

圖2是不同濃度A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h的顯微成像圖，與接種0 h相比，培養(yǎng)24 h后3 000 cells/mL濃度的A549細(xì)胞密度為70%-80%左右；1 500 cells/mL濃度的A549細(xì)胞密度為40%-50%左右；而 5 000 cells/mL、10 000 cells/mL、20 000 cells/mL濃度的A549細(xì)胞密度超過90%且細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)皺縮。

圖1 實(shí)時監(jiān)測24 h A549細(xì)胞濃度依賴性生長曲線模型

綜上兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定3000 cells/mL濃度的A549細(xì)胞作為后續(xù)藥物處理的最佳細(xì)胞濃度模型。

圖2 不同濃度A549細(xì)胞顯微成像圖

圖3 實(shí)時監(jiān)測順鉑作用A549細(xì)胞的時間/藥物劑量依賴性曲線圖譜

2.2 xCELLigence-RTCA動態(tài)監(jiān)測不同濃度順鉑作用A549細(xì)胞凋亡情況

A549細(xì)胞鋪板增殖生長約26 h后時進(jìn)行加藥處理，取此時CI值歸一化為1。如圖3所示，系統(tǒng)繼續(xù)監(jiān)測72 h順鉑作用A549細(xì)胞的時間/藥物劑量依賴性曲線發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，順鉑在作用11 h后A549細(xì)胞增殖曲線開始出現(xiàn)下降趨勢，作用48 h后所有A549細(xì)胞增殖曲線下降，作用72 h后，對照組A549細(xì)胞生長曲線開始下降。分析不同時間點(diǎn)順鉑作用的A549細(xì)胞存活率，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。從圖5發(fā)現(xiàn)IC50值在加藥24 h后保持相對穩(wěn)定，通過xCELLigence-RTCA系統(tǒng)軟件計(jì)算順鉑作用 72h 的 IC50值為 2.614 μg/mL（圖 6）。

圖4 不同濃度順鉑作用A549細(xì)胞不同時間的細(xì)胞存活率

圖5 順鉑作用后的時間依賴IC50值變化圖

圖6 順鉑作用72 h計(jì)算的IC50值

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度順鉑在不同檢測時間點(diǎn)對A549細(xì)胞凋亡的影響

圖7為運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑對A549細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果。根據(jù)xCELLigence-RTCA系統(tǒng)檢測的順鉑作用A549細(xì)胞凋亡結(jié)果分析，選取1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 三種濃度順鉑分別處理 A549細(xì)胞11、48、72 h，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果如圖7-A所示，與對照組相比：1 μg/mL順鉑作用了11 h、48 h、72 h細(xì)胞凋亡率分別為5.47%±0.29、30.4%±0.87、44.2%±0.62。2 μg/mL順鉑作用了11 h、48 h、72 h細(xì)胞凋亡率分別為28.27%±0.82、52.73%±0.65、73.43%±1.23。4 μg/mL 順鉑作用了11 h、48 h、72 h細(xì)胞凋亡率分別為35%±0.57、79.1%±1.22、95.2%±1.12。

圖7 流式檢測順鉑對A549細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

2.3.1 不同濃度順鉑作用相同時間的A549細(xì)胞凋亡情況 如圖7-B所示，3種濃度順鉑作用11、48、72 h后，與對照組相比，A549細(xì)胞的凋亡趨勢明顯，順鉑濃度越高，A549細(xì)胞凋亡率增加趨勢越顯著（P＜ 0.05）。

2.3.2 相同濃度順鉑作用不同時間的A549細(xì)胞凋亡情況 與對照組相比，從圖7-C統(tǒng)計(jì)圖發(fā)現(xiàn)：隨著3種濃度順鉑作用時間的增加，A549細(xì)胞凋亡趨勢呈顯著性變化（P＜ 0.05）。

2.3.3 xCELLigence-RTCA技術(shù)輔助流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑作用A549細(xì)胞的凋亡情況 如圖7-D發(fā)現(xiàn)，隨著順鉑濃度的增加或順鉑作用時間的增加，A549細(xì)胞的凋亡增加趨勢顯著（P＜ 0.05），與xCELLigence-RTCA系統(tǒng)監(jiān)測的A549細(xì)胞的時間/藥物劑量依賴性曲線結(jié)果一致。因此在細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中，通過分析xCELLigence-RTCA細(xì)胞功能分析系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測的值，可確定細(xì)胞凋亡的最佳檢測時間點(diǎn)和藥物濃度，為流式細(xì)胞術(shù)的凋亡檢測提供可靠的條件。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國肺癌居于惡性腫瘤死亡率的首位，其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%以上，因此在人均壽命增長的同時，惡性腫瘤已成為人類死亡的首要疾病和因素［13-15］。肺癌早期診斷率極低，因此細(xì)胞凋亡檢測對于基礎(chǔ)研究和臨床診斷具有重要意義。流式細(xì)胞分析法可對單個細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析，是定量檢測細(xì)胞凋亡的重要方法之一［7］。但是該方法檢測指標(biāo)單一，僅僅給實(shí)驗(yàn)定格了一個最終結(jié)果，往往由于時間點(diǎn)的選取不確定性，而漏掉藥物作用的瞬間反應(yīng)變化，給細(xì)胞凋亡活性檢測帶來了一定的難度，因此選擇合適的檢測時間很重要［16］。

xCELLigence細(xì)胞功能分析系統(tǒng)可以進(jìn)行無標(biāo)記、實(shí)時、動態(tài)的監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的凋亡變化過程，獲得完整的動態(tài)曲線圖譜和細(xì)胞指數(shù)值，從而確定藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的給藥時間點(diǎn)和給藥劑量，因此也減少了因流式細(xì)胞術(shù)在給藥時間和給藥劑量上做的摸索［8-11］。但根據(jù)細(xì)胞指數(shù)值來確定細(xì)胞凋亡最佳檢測時間點(diǎn)和給藥劑量的研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)鮮少報(bào)道［17］。本研究結(jié)合xCELLigence系統(tǒng)監(jiān)測的順鉑作用曲線和流式細(xì)胞術(shù)檢測分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物作用的CI值降低，細(xì)胞凋亡趨勢增加。CI值降到最低時，細(xì)胞存活率最低。研究還發(fā)現(xiàn)不同劑量順鉑誘導(dǎo)后，A549細(xì)胞指數(shù)達(dá)到最低值所需要的時間并不相同，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的時間點(diǎn)和合適的藥物濃度也不相同，因此藥物劑量和作用時間對細(xì)胞凋亡會產(chǎn)生不用的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道相一致［17］，聯(lián)合兩種技術(shù)為藥物細(xì)胞模型的多種功能研究找到了的新手段，為細(xì)胞凋亡檢測的應(yīng)用開發(fā)提供良好的平臺。

4 結(jié)論

在細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中，xCELLigence-RTCA細(xì)胞功能分析系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測的值可用于確定細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的最佳檢測時間點(diǎn)和藥物濃度。聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)的精準(zhǔn)定量技術(shù)，確定這種實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞凋亡篩選技術(shù)體系用于腫瘤細(xì)胞凋亡篩選的可行性和可靠性，該技術(shù)體系的建立將為藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞活性研究方面的應(yīng)用提供支持和推廣。