陳丹丹 劉宏波

摘要：3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）是甘油脂生物合成途徑中催化第1步?；磻?yīng)的關(guān)鍵酶，參與生物體的不同代謝途徑，發(fā)揮著不同的生理功能。本研究對(duì)已構(gòu)建的GPAT基因酵母遺傳互補(bǔ)篩選體系進(jìn)行優(yōu)化，通過替換酵母表達(dá)載體pYES2-Kan-yADH1 v1中ADH1啟動(dòng)子，增強(qiáng)目的基因的表達(dá);同時(shí)，在酵母遺傳轉(zhuǎn)化后對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，增加陽性菌落數(shù)目。該體系的優(yōu)化將進(jìn)一步提高GPAT酶的篩選效率。

關(guān)鍵詞：3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶;啟動(dòng)子;酵母;遺傳互補(bǔ)

中圖分類號(hào)： Q344+.13;S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）13-0064-03

三酰甘油（triacylglyceride，TAG）是植物油脂的主要儲(chǔ)存形式，其從頭合成途徑受3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）的催化，即將?；o酶A或?；?ACP的?；糠洲D(zhuǎn)移到3-磷酸甘油的sn-1位生成溶血磷脂酸[1]，這是甘油脂從頭合成途徑中的第1步限速反應(yīng)。因此，GPAT酶在細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝、植物的生長發(fā)育及油料作物的產(chǎn)量和品質(zhì)改良等方面具有重要作用[1-3]。然而，迄今為止，植物中究竟有多少不同的基因編碼線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的GPAT酶還不清楚，主要原因是缺乏有效分離和鑒定GPAT基因的手段。目前研究者常用的GPAT酶分析手段有2種，一種是利用放射性同位素標(biāo)記的3-磷酸甘油來體外測(cè)定酶活性[4]，但這種方法操作不便，且不適用于GPAT基因的大規(guī)模研究;另一種是利用甘油營養(yǎng)缺陷型Escherichia coli plsB突變體的遺傳互補(bǔ)來研究原核生物的GPAT酶[5-6]，然而該方法并不適用于真核生物的GPAT酶的篩選。雷潔等根據(jù)高等和低等真核生物中甘油脂合成中第1步?；磻?yīng)的高度保守性建立了一套可快速有效地大規(guī)模篩選真核生物GPAT基因的酵母遺傳互補(bǔ)體系，該體系是基于在組成型ADH1啟動(dòng)子下外源候選GPAT基因的表達(dá)可以恢復(fù)gat1/gat2雙敲除酵母菌株在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長缺陷所建立的[7]。

乙醇脫氫酶Ⅰ的酵母ADH1啟動(dòng)子全長約1 500 bp，該片段中的上游啟動(dòng)子元件激活后，酵母的乙醇脫氫酶ADH1基因會(huì)轉(zhuǎn)錄成一段較長的mRNA，同時(shí)由于存在多個(gè)起始和終止密碼子，導(dǎo)致ADH1酶無法正常翻譯，這被認(rèn)為是一個(gè)下調(diào)機(jī)制[8]。研究發(fā)現(xiàn)，不同長度的ADH1啟動(dòng)子的活性有所不同，截?cái)嗟腁DH1啟動(dòng)子具有組成型活性[9]，如Ruohonen等發(fā)現(xiàn)在解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶代謝中，酵母的乙醇脫氫酶ADH1p將乙醛還原成乙醇[10]，當(dāng)ADH1啟動(dòng)子序列上游的1 100 bp（-414～-1 500 bp）去除之后，短的啟動(dòng)子只在乙醇產(chǎn)生后期有活性[11]，將上游的300 bp（-414～-700 bp）保留后，在整個(gè)乙醇產(chǎn)生階段都有ADH1啟動(dòng)子的活性[12]。Santangelo等發(fā)現(xiàn)，ADH1啟動(dòng)子的活性與啟動(dòng)子上-664～-652 bp的UAS保守序列有關(guān)[13]，該順式作用元件與上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄。

為了提高GPAT基因的篩選效率，本研究對(duì)該酵母遺傳互補(bǔ)體系進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)在Lei等用的397 bp（-670～-1 066 bp）ADH1啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上[7]，繼續(xù)延長上游307 bp（-363～-669 bp）的序列，得到長度為 704 bp 的ADH1啟動(dòng)子序列，以At5g06090基因作為參考基因比較2種啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的影響;同時(shí)，在酵母遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)對(duì)酵母雙突變體轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，以期提高外源GPAT基因的表達(dá)和篩選效率。

1 材料與方法

1.1 704 bp ADH1啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

采用玻璃珠法提取野生型酵母菌株BY4742的基因組DNA，根據(jù)GenBank報(bào)道的ADH1啟動(dòng)子序列，以表1所示引物FP1和RP1進(jìn)行第1次擴(kuò)增，以表1所示含酶切位點(diǎn)的引物FP2和RP2進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

1.2 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

以Lei等構(gòu)建的yADH1-Kan-pYES2 v1質(zhì)粒為骨架[7]，用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ分別對(duì)載體和回收純化后的第2次PCR產(chǎn)物酶切2 h，膠回收酶切產(chǎn)物及載體去磷酸化后，將ADH1啟動(dòng)子片段和yADH1-Kan-pYES2 v1質(zhì)粒載體在 16 ℃ 下連接過夜。

取2 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于具有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。在含有轉(zhuǎn)化子的平板上隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落，在含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁培養(yǎng)后經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證并測(cè)序，引物FP1和RP3見表1。將含有704 bp ADH1啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒命名為yADH1-Kan-pYES2 v2。

以At5g06090-YEplac181質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增At5g06090基因，引物見表1，之后進(jìn)行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，yADH1-Kan-pYES2 v2重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后在16 ℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于具有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜;提取陽性單克隆的質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.3 2種ADH1啟動(dòng)子對(duì)目的基因表達(dá)的效果比較

通過LiAc法把2種重組質(zhì)粒導(dǎo)入Lei等構(gòu)建的酵母菌株ZAFU1中[7]，以空載體為陰性對(duì)照。在涂板前，對(duì)含有2種重組質(zhì)粒的酵母雙突變體均作復(fù)蘇和不復(fù)蘇培養(yǎng)，復(fù)蘇即將涂板前的菌體在含2%葡萄糖和全氨基酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，最后都在含2%葡萄糖和2%半乳糖的酵母氨基酸缺陷型合成固體培養(yǎng)基[SC/-ura（尿嘧啶）-his（組氨酸）-leu（亮氨酸）]固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，觀察菌落的生長狀況，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

隨后，利用濃度梯度稀釋試驗(yàn)（初始D600 nm為1），即用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)半乳糖和葡萄糖培養(yǎng)基上生長的菌落，再依次稀釋5倍，分別點(diǎn)在含半乳糖或葡萄糖的SC/-ura-his-leu固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，比較不同長度啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)條件對(duì)外源基因表達(dá)的影響和互補(bǔ)效果。

1.4 驗(yàn)證ZAFU1中的At5g06090基因

分別提取轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇與未復(fù)蘇培養(yǎng)的葡萄糖培養(yǎng)基上的酵母雙突變體的基因組DNA和酵母表達(dá)質(zhì)粒的混合物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物FP3和RP3見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 704 bp ADH1啟動(dòng)子的獲得

以提取的野生型酵母基因組DNA為模板，將擴(kuò)增得到的704 bp的ADH1啟動(dòng)子序列替換yADH1-Kan-pYES2 v1上的397 bp的序列，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增出1條大小為848 bp的條帶，結(jié)果見圖1。

2.2 At5g06090-yADH1-Kan-pYES2 v2載體的雙酶切鑒定

由圖2可見，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，重組質(zhì)粒在6.8 kb（載體片段位置）出現(xiàn)1條相應(yīng)的條帶，在200、1 500 bp左右（目的片段位置）各出現(xiàn)1條條帶，說明At5g06090基因已經(jīng)插入到y(tǒng)ADH1-

Kan-pYES2 v2質(zhì)粒中。

2.3 2種ADH1啟動(dòng)子對(duì)目的基因表達(dá)的效果比較

將2種重組質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ZAFU1，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)3 d后不同培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)，結(jié)果見表2。將半乳糖和葡萄糖上的單個(gè)菌落按1 ∶ 5稀釋，涂布在含半乳糖或葡萄糖的SC/-ura-his-leu固體培養(yǎng)基中，菌落生長情況見圖3。替換后的啟動(dòng)子及復(fù)蘇培養(yǎng)可以增加菌落數(shù)，初步說明At5g06090基因在704 bp啟動(dòng)子的作用下能夠增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。

2.4 驗(yàn)證ZAFU1中的At5g06090基因

提取在葡萄糖培養(yǎng)基中生長的酵母表達(dá)質(zhì)粒和基因組DNA的混合物，經(jīng)PCR可擴(kuò)增出1條包含At5g06090基因的1 726 bp的條帶，說明重組質(zhì)粒存在于酵母雙突變體中，結(jié)果見圖4。

3 討論與結(jié)論

利用酵母異源互補(bǔ)的方法研究目的基因的功能，已成為研究人員常用的生物學(xué)研究手段，如利用酵母異源互補(bǔ)研究鐵、鋅等離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能[14]。本研究的酵母遺傳互補(bǔ)體系是利用gat1/gat2缺陷型酵母菌株在葡萄糖上的生長依賴于外源GPAT基因的表達(dá)所建立的，而外源基因的表達(dá)受ADH1啟動(dòng)子的控制，有文獻(xiàn)報(bào)道ADH1啟動(dòng)子的5′末端區(qū)域有類似于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和調(diào)節(jié)蛋白ADR1結(jié)合位點(diǎn)的序列[15]，這些序列元件決定啟動(dòng)子的作用。本研究將啟動(dòng)子的長度延長至704 bp，利用At5g06090基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)替換后的啟動(dòng)子確實(shí)能夠增強(qiáng)目的基因的表達(dá)，復(fù)蘇后也可以增加葡萄糖培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，可能在復(fù)蘇時(shí)，全營養(yǎng)培養(yǎng)基能夠?yàn)榛钚圆惶叩木晏峁I養(yǎng)，使其恢復(fù)到正常生長狀態(tài)。但基因的表達(dá)水平不僅取決于啟動(dòng)子[16-19]，還與基因的拷貝數(shù)相關(guān)[20]，在轉(zhuǎn)化中，雖然總質(zhì)粒數(shù)是相同的，但每個(gè)酵母單細(xì)胞所含有的質(zhì)粒數(shù)是不可控制的，從表型上看，替換后的啟動(dòng)子可以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但仍需要進(jìn)行基因的表達(dá)量分析來進(jìn)一步驗(yàn)證候選GPAT基因的遺傳互補(bǔ)功能。

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