郭英姿 賈文慶 周秀梅

摘要：以早開堇菜新鮮花粉為試材，使用掃描電鏡觀察花粉表觀形態(tài)，采用雙重二因素試驗用離體培養(yǎng)法研究不同培養(yǎng)基組分對花粉萌發(fā)的影響，篩選最佳的貯藏方法，并探討花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)與花粉萌發(fā)之間的關(guān)系。結(jié)果表明：蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)具有促進(jìn)作用。在280 g/L蔗糖和240 mg/L硼酸的條件下花粉萌發(fā)率最高，為72.29%;在 90 mg/L GA3和200 mg/L Ca（NO3）2的條件下花粉萌發(fā)率峰值為82.48%。確定花粉離體培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基為：蔗糖280 g/L、GA3 90 mg/L、Ca（NO3）2 200 mg/L、硼酸240 mg/L?；ǚ勖劝l(fā)率隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，相同時間內(nèi)貯藏溫度越低花粉萌發(fā)率越高，早開堇菜花粉最佳的貯藏的條件為-80 ℃;花粉形態(tài)與其萌發(fā)率之間有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：早開堇菜;生活力;萌發(fā);培養(yǎng)基成分;貯藏

中圖分類號： S567.23+9.035.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0191-04

早開堇菜（Viola prionantha Bunge）又名早花地丁，為堇菜科堇菜屬多年生草本植物。全草藥用，有活血化瘀，除膿消炎;搗爛涂于患處，可排膿、活血和生肌[1]。植株低矮、春季返青比較早，植株長勢茂盛，在早春和晚秋開花，花期集中，花型奇特、色澤醒目、株型雅致，具有較高的觀賞價值。早開堇菜有適應(yīng)性廣、生長迅速、抗逆性強(qiáng)、競爭力強(qiáng)等特點，可廣泛用于地被、林下地被、花境、花壇、綴花草坪等，具有廣闊的園林開發(fā)應(yīng)用前景[2-3]。

雜交培育新品種是改良植物的重要途徑，也是植物資源開發(fā)利用的主要方法。堇菜屬植物生殖特性的研究是提高堇菜屬植物育種效率的基礎(chǔ)。在進(jìn)行人工授粉、雜交育種時都需要大量花粉，雜交育種有時因花期不遇、空間障礙等原因，必須有效地貯藏花粉，花粉壽命長短對植物授粉受精結(jié)實繁殖能力等方面具有重要意義[4]。在授粉前對花粉進(jìn)行生活力的測定，可以避免因使用低生活力的花粉而造成育種時間和成本的浪費(fèi)，以便對雜交結(jié)果進(jìn)行分析和研究[5]。而花粉萌發(fā)生活力測定是人工篩選或雜交育種的前提，離體培養(yǎng)法是檢測花粉萌發(fā)率最準(zhǔn)確的方法之一?；ǚ坶L期貯藏對種質(zhì)保存和雜交育種十分重要，長期保存花粉的必要條件就是低溫處理。目前國內(nèi)學(xué)者對早開堇菜的資源概況[2-3，6]、生物學(xué)特性[7]、揮發(fā)性成分[1]、抗性[8]等進(jìn)行了深入的研究，但對其花粉生活力及貯藏的研究尚未見報道。為此本研究采用離體培養(yǎng)法對早開堇菜花粉萌發(fā)特性進(jìn)行探討，探究了早開堇菜花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基及最佳貯藏方法，并分析了花粉形態(tài)與萌發(fā)率之間的關(guān)系，以期為早開堇菜的雜交育種和花粉儲藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的采集與處理

試驗于2017年3月上旬展開，選擇晴天08：30—11：00，在河南科技學(xué)院校園內(nèi)采集早開堇菜初花期含苞待放花朵為宜，此時花粉還未散出，花粉量大、生活力好。帶回實驗室后，一部分用鑷子剝?nèi)』ㄋ幹糜诜庞辛蛩峒埖呐囵B(yǎng)皿內(nèi)，置于（25±1） ℃培養(yǎng)箱內(nèi)散粉24 h后，收集花粉，待掃描花粉形態(tài)備用。一部分新鮮花粉直接用于離體萌發(fā)試驗，待測花粉生活力。其余花粉干燥后裝入放有硅膠的離心管密封保存，設(shè)置常溫、4 ℃（低溫）、-20 ℃、-80 ℃（超低溫）4種貯藏溫度，進(jìn)行長期貯藏。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀察 將干燥的花粉均勻撒布在黑色導(dǎo)電膠上，放在掃描電鏡下觀察拍照。選取有代表性的花粉粒進(jìn)行觀察，各類型的花粉粒測20粒，取平均值，記錄花粉的極軸和赤道長度并計算P/E值;觀察花粉遠(yuǎn)極面、近極面和局部的外壁紋飾、網(wǎng)眼大小、網(wǎng)脊寬度，測量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 不同蔗糖、硼酸處理對花粉萌發(fā)的影響 試驗采用二因素完全隨機(jī)處理方法，共36個組合，濃度梯度分別為：蔗糖：蒸餾水作為對照，蔗糖濃度設(shè)為200、230、260、280、310 g/L;硼酸：蒸餾水作為對照，硼酸濃度設(shè)為200、220、240、260、280 mg/L。各培養(yǎng)基均加入9 g/L瓊脂、pH值調(diào)至5.8。用玻璃棒滴培養(yǎng)液于凹玻片的凹處，裝滿為止，稍冷卻后用干凈的毛筆蘸取少許花粉均勻撒播于培養(yǎng)基表面。將凹玻片放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。置于（25±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱、相對濕度保持70%～80%，暗培養(yǎng)15 h后，放在NIKON 50i顯微鏡下拍照并統(tǒng)計萌發(fā)率?；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)觀察3個視野，每視野≥100?；ǚ?，統(tǒng)計萌發(fā)率[9-10]。

花粉萌發(fā)率=花粉萌發(fā)粒數(shù)/花粉總粒數(shù)×100%。

1.2.3 不同赤霉素、硝酸鈣處理對花粉萌發(fā)的影響 在試驗得出的最佳培養(yǎng)基中加入GA3、Ca（NO3）2，在此基礎(chǔ)上采用二因素完全隨機(jī)處理試驗，依據(jù)不同處理的花粉萌發(fā)率，確定最佳的GA3和Ca（NO3）2濃度。濃度梯度分別為：GA3：蒸餾水作為對照，GA3濃度設(shè)為30、60、90、120、150 mg/L，Ca（NO3）2：蒸餾水作為對照，Ca（NO3）2濃度設(shè)為50、100、150、200、250 mg/L，pH值調(diào)至5.8。花粉萌發(fā)的測定方法同上。

1.2.4 不同貯藏溫度對早開堇菜花粉萌發(fā)的影響 將真空干燥的花粉，設(shè)置常溫、4 ℃（低溫）、-20 ℃、-80 ℃（超低溫）4種貯藏溫度，將花粉裝入放有硅膠干燥劑的5 mL試管中，用棉花封口。貯藏60、120、180、240、300、360 d后，分別從4種貯藏條件的離心管中各取出少許花粉（-80 ℃下貯藏的花粉放-20 ℃預(yù)處理解凍，在-20 ℃冰箱中冷凍的花粉應(yīng)在 4 ℃ 的冰箱中緩沖15 min后再培養(yǎng)），取少許采用試驗所得最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)測定萌發(fā)率，以新鮮花粉的萌發(fā)率作對照，測定方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 早開堇菜表觀形態(tài)

從圖1-A、圖1-B可以看出早開堇菜花粉粒均為長橢球形，早開堇菜花粉粒平均極軸長為21.93 μm，平均赤道軸長約10.08 μm，P/E≈2.176，屬于小型花粉。其中少數(shù)呈船型或不規(guī)則形狀。從圖1-B、圖1-C、圖1-D可以看出，早開堇菜花粉表面較為光滑，為小穴狀雕飾紋，網(wǎng)脊細(xì)而彎曲，較為均勻。早開堇菜花粉粒形態(tài)呈兩側(cè)對稱，花粉赤道面觀長橢圓形，兩端漸窄，極面觀三裂圓形，花粉具3孔溝[11]，溝膜較明顯，延伸至兩極，萌發(fā)溝呈兩極寬中間窄，溝寬約 0.88 μm，溝長快達(dá)到花粉粒兩端，長度平均約18.02 μm，溝區(qū)有光滑的溝膜。

2.2 蔗糖、硼酸對花粉萌發(fā)率的影響

不同蔗糖、硼酸濃度對早開堇菜花粉萌發(fā)的影響差異顯著（表1、圖2）。表1表明，早開堇菜在蔗糖、硼酸濃度都為0和單獨(dú)添加蔗糖或者硼酸時萌發(fā)率都較低，在恒溫培養(yǎng)箱（25±1） ℃持續(xù)培養(yǎng)15 h后，空白培養(yǎng)基花粉的萌發(fā)率僅為20.27%，單獨(dú)使用蔗糖時，隨著蔗糖濃度的增加，花粉的萌發(fā)率呈先上升后降低的趨勢。蔗糖濃度為280 g/L，萌發(fā)率最高，達(dá)25.76%，顯著高于其他處理;但隨著蔗糖濃度持續(xù)增加，花粉的萌發(fā)率呈下降趨勢，在蔗糖的濃度為300 g/L時，花粉萌發(fā)率降至22.91%。

硼能促進(jìn)糖的吸收與代謝，且有利于花粉管壁的形成，減少花粉破裂，提高花粉的萌發(fā)率，促使花粉管生長伸長[7]。表1結(jié)果顯示，單獨(dú)使用硼酸時，早開堇菜花粉萌發(fā)率隨著硼酸質(zhì)量濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。硼酸的質(zhì)量濃度為240 mg/L時，早開堇菜的花粉萌發(fā)率最高，達(dá)31.74%;隨著硼酸濃度持續(xù)增加，花粉萌發(fā)率顯著下降，當(dāng)硼酸的質(zhì)量濃度為280 mg/L時，花粉的萌發(fā)率僅為26.82%。

這表明高質(zhì)量濃度蔗糖、硼酸對花粉萌發(fā)有抑制作用。研究結(jié)果顯示：供試的36種培養(yǎng)基中，蔗糖和硼酸濃度分別為280 g/L、240 mg/L時，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)72.29%，顯著高于其他組合，可以表明該培養(yǎng)基為早開堇菜花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。這表明添加一定含量的蔗糖、硼酸對早開堇菜花粉萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用。

2.3 赤霉素、硝酸鈣對花粉萌發(fā)率的影響

赤霉素是影響花粉萌發(fā)的重要因素之一。由表2可以看出，赤霉素添加后，早開堇菜花粉萌發(fā)率有較顯著的變化，呈先增加后降低的趨勢。赤霉素為90 mg/L時，萌發(fā)率達(dá)到了峰值，為78.34%，當(dāng)赤霉素濃度為150 mg/L時，萌發(fā)率隨赤霉素濃度增加反而下降，為57.14%， 這表明高質(zhì)量濃度的赤霉素使花粉萌發(fā)受到抑制。

硝酸鈣對早開堇菜花粉的萌發(fā)具有一定的相關(guān)性。硝酸鈣晶體易溶于水，可以隨其他易溶試劑直接加入蒸餾水中配制培養(yǎng)基。由表2可知，在最佳蔗糖濃度280 g/L的培養(yǎng)基中加入Ca2+后，很明顯抑制了早開堇菜花粉的萌發(fā)，隨著硝酸鈣質(zhì)量濃度不斷增大，花粉萌發(fā)率呈先增加后下降的趨勢，硝酸鈣濃度為250 mg/L時，早開堇菜花粉萌發(fā)率降至 69.87%，萌發(fā)率明顯低于無硝酸鈣時的72.29%。Ca（NO3）2的質(zhì)量濃度為200 mg/L時，早開堇菜花粉的萌發(fā)率達(dá)到頂峰值，為72.82%。

供試的36種培養(yǎng)基中，赤霉素和硝酸鈣濃度分別為 90 g/L、200 mg/L時，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)82.48%，顯著高于其他組合。綜上所述，依據(jù)不同組合的花粉萌發(fā)率，確定早開堇菜花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為：蔗糖280 g/L+GA3 90 mg/L+Ca（NO3）2 200 mg/L+硼酸240 mg/L。

2.4 不同貯藏時間和溫度對早開堇菜花粉萌發(fā)的影響

圖3結(jié)果表明，貯藏環(huán)境對早開堇菜花粉的萌發(fā)率影響顯著，貯藏不同時間后花粉活力差異較大。在4種貯藏溫度條件下，隨著貯藏時間延長，早開堇菜花粉萌發(fā)率均呈下降趨勢。室溫下萌發(fā)率下降最快，貯藏120 d后，花粉幾乎喪失生活力，貯藏時間最短;與室溫相比，4 ℃條件下花粉貯藏時間明顯延長，隨著貯藏時間的延長，萌發(fā)率呈緩慢下降的趨勢，貯藏360 d萌發(fā)率下降到38.8%;-20 ℃貯藏條件下，花粉萌發(fā)率下降趨勢較4 ℃條件下的小很多，貯藏360 d后萌發(fā)率仍有52.91%;-80 ℃條件下貯藏的花粉萌發(fā)率下降幅度較小，變化曲線較平緩，顯著優(yōu)于4 ℃和-20 ℃，貯藏360 d后，花粉萌發(fā)率仍達(dá)61.69%，花粉管形態(tài)正常。綜上所述，適宜早開堇菜花粉貯藏的條件為-80 ℃。

3 小結(jié)與討論

花粉形態(tài)是植物分類鑒定、確定親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的重要指標(biāo)。物種不同，花粉的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及大小也有差異[12]。本研究結(jié)果表明：早開堇菜屬于小型花粉，表面光滑，早開堇菜畸形花粉所占比率（13.18%），與離體萌發(fā)法所得萌發(fā)率（82.48%）結(jié)合來看，二者具有一定關(guān)系，說明花粉萌發(fā)與花粉形態(tài)有相關(guān)性。分析出現(xiàn)畸形花粉原因可能是早開堇菜繁殖力差，花粉敗育。

離體萌發(fā)法操作簡便、快速，結(jié)果直觀可靠，幾乎適用于所有植物的花粉生活力測定，但不同的材料需要不同的培養(yǎng)基[13]。本試驗通過二因素完全隨機(jī)處理試驗，篩選出最適宜早開堇菜花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基組合為：蔗糖280 g/L+GA3 90 mg/L+Ca（NO3）2 200 mg/L+硼酸240 mg/L。

蔗糖是花粉萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源，不同植物種類甚至品種其花粉離體培養(yǎng)對蔗糖濃度要求不同。這可能是由于不同植物、品種的花粉細(xì)胞中內(nèi)含物含量不同，要求適宜的細(xì)胞壁內(nèi)外滲透壓才能生長。胞內(nèi)滲透壓低于胞外，易造成胞內(nèi)水分外滲，高于胞外則造成細(xì)胞過分膨脹，都不利于花粉細(xì)胞生長[14]。本研究結(jié)果表明，蔗糖是影響早開堇菜花粉萌發(fā)的主要因子，蔗糖的質(zhì)量濃度為280 g/L時，花粉萌發(fā)效率達(dá)到峰值，當(dāng)蔗糖的質(zhì)量濃度超過280 g/L時，萌發(fā)率和蔗糖質(zhì)量濃度成反比，原因可能是蔗糖質(zhì)量濃度低，滲透壓就比較低，會導(dǎo)致花粉壁破裂，內(nèi)容物流出，花粉萌發(fā)率降低;蔗糖的質(zhì)量濃度高時，發(fā)生質(zhì)壁分離，又阻礙了花粉的發(fā)育[15]。適量硼也是花粉萌發(fā)和生長所必需的，硼酸有助于糖的吸收和利用，提高新陳代謝，硼還參與早開堇菜花粉組織的形成，可以減少花粉破裂，提高耗氧速度，有利于花粉管組織的合成和花粉管的伸長生長[16-19]，本試驗結(jié)果顯示：硼酸的質(zhì)量濃度為240 mg/L時，早開堇菜的花粉萌發(fā)率達(dá)到峰值，為31.74%;隨著硼酸濃度持續(xù)增加，萌發(fā)率隨硼酸質(zhì)量濃度的增大而降低，分析可能的原因是硼的含量過多，抑制了花粉的新陳代謝，從而影響和抑制花粉活力。赤霉素可刺激花粉的萌發(fā)，促進(jìn)花粉管生長，提高萌發(fā)率。大部分赤霉素促進(jìn)花粉萌發(fā)的研究結(jié)果顯示：50 mg/L以下的低濃度赤霉素對花粉萌發(fā)和花粉管生長有明顯的促進(jìn)作用[8]。本研究結(jié)果表明，90 mg/L GA3對早開堇菜花粉萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，這表明，低濃度的赤霉素能促進(jìn)早開堇菜花粉萌發(fā)，120 mg/L的GA3出現(xiàn)抑制作用。Ca2+誘導(dǎo)花粉管產(chǎn)生一定的趨向性，使花粉管朝Ca2+濃度高的方向生長。硝酸鈣的主要作用是提供鈣元素，補(bǔ)充氮元素，具有快速補(bǔ)給鈣、氮的特點[16，20]。Ca2+的濃度影響著花粉管的生長速度和形態(tài)特征，但花粉萌發(fā)和生長都需要控制在一定的組分濃度內(nèi)，過高、過低均不利于花粉管的萌發(fā)和生長[15]，關(guān)于早開堇菜Ca2+誘導(dǎo)花粉管的研究尚未見報道，本試驗結(jié)果表明，200 mg/L硝酸鈣對早開堇菜花粉萌發(fā)具有促進(jìn)作用。

本試驗結(jié)果顯示，早開堇菜花粉萌發(fā)率最高一般維持在80%左右，推斷花粉生活力的強(qiáng)弱主要取決于種（品種）自身的遺傳特性，但培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等其他外界條件也會影響到花粉萌發(fā)率[21-23]，有待于進(jìn)一步研究。

貯藏溫度影響花粉萌發(fā)下降速度[21]，本研究結(jié)果表明，在4種貯藏溫度條件下，隨著貯藏時間延長，花粉萌發(fā)率均呈下降趨勢，室溫下萌發(fā)率下降最快，貯藏時間最短。室溫貯藏120 d后花粉幾乎喪失生活力，可能是因為溫度高增強(qiáng)了花粉內(nèi)部呼吸強(qiáng)度，從而導(dǎo)致花粉營養(yǎng)枯竭，同時室內(nèi)溫度、濕度又會使花粉脫水變質(zhì)死亡[21]。4 ℃貯藏360 d后，萌發(fā)率為43.64%，長期貯藏仍表現(xiàn)較高的萌發(fā)率，但-80 ℃低溫處理后萌發(fā)率最佳，貯藏360 d后萌發(fā)率仍達(dá)到61.69%，適合花粉長期貯藏。說明溫度越低越有利于早開堇菜花粉的長時間保存，這與大多數(shù)研究結(jié)果[4，14，21]一致。這是因為花粉在貯藏過程中仍然進(jìn)行新陳代謝等生命活動，低溫可以使貯藏期間的花粉呼吸減弱，可溶性糖類等消耗減少，從而保持較長時間的生活力[21，24]。與-80 ℃相比，4 ℃條件貯藏的花粉耗能低，節(jié)約生產(chǎn)成本。從貯藏效果看，-80 ℃是長期貯藏適宜的溫度。堇菜屬遠(yuǎn)緣雜交育種，時常花期不遇，可以利用此方法長期保存花粉，貯藏360 d后正是堇菜屬植物的盛花期，為雜交育種的最佳時期。本實驗室前期研究的牡丹、三色堇 4 ℃ 貯藏120 d后，花粉萌發(fā)率基本降為0，推斷原因可能是花粉含水量高、腐爛造成萌發(fā)率降低[1，9]。本試驗結(jié)果顯示 4 ℃ 經(jīng)過近1年的貯藏后早開堇菜花粉仍具有較高的生活力，推斷原因可能與前期的花粉干燥程度有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

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