南四湖底泥耐鉛菌株的分離鑒定及吸附特性

董欣 袁坤 徐佳

摘要：重金屬污染土壤中的微生物對重金屬有較強的耐受能力并能起到富集作用，是進行土壤凈化的重要力量。分離鑒定南四湖底泥中的抗鉛菌株，并且對其吸附特性進行研究。從南四湖底泥中采集土樣，經(jīng)過分離、培養(yǎng)，最終篩選出2株抗鉛菌株。對所得菌株進行16S rDNA測序和序列相似性分析，鑒定其種屬后對其Pb2+質量吸附特性進行研究。結果：菌株1D、8A最大耐Pb2+濃度分別為700 mg/L和600 mg/L。16S rDNA序列相似性分析表明，菌株1D、8A分別與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、彭氏變形桿菌（Proteus penneri）親緣關系最近。經(jīng)過吸附性能測試，菌株1D在 35 ℃、pH值=5、Pb2+質量濃度為100 mg/L、菌體投放量為30 g/L、轉速為180 r/min、吸附時間為15 min時吸附效率最高;菌株8A在20 ℃、pH值=7、Pb2+質量濃度為300 mg/L、菌體投放量為20 g/L、轉速為180 r/min、吸附時間為 5 min 時吸附效率最高。此外，2株菌株對Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe2+等重金屬也有一定的耐受性。篩選到的菌株抗鉛性能高、吸附性好，豐富了微生物修復的生物資源庫，同時對于吸附特性的研究又可以為抗重金屬菌株篩選提供參考。

關鍵詞：鉛;吸附;蠟樣芽孢桿菌;彭氏變形桿菌

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0314-06

南四湖屬于典型的內陸淺水型淡水湖泊，由南陽湖、獨山湖、昭陽湖和微山湖串聯(lián)在一起組成，是山東省的“生態(tài)寶庫”，是南水北調東線工程的重要樞紐和調蓄湖泊，水質安全至關重要。

長期以來，重金屬污染是影響南四湖水質的重要因素。2003年和2005年對南四湖表層沉積物重金屬元素的污染分析顯示，南陽湖和獨山湖的Pb污染較重[1-2]。2010年對南四湖表層沉積物重金屬的賦存形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，南陽湖區(qū)沉積物間隙水及界面上覆水中Pb的濃度均高于獨山湖區(qū)，并與沉積物中重金屬元素的有效結合態(tài)含量變化一致[3]。2013年對南四湖表層沉積物重金屬的空間分布、來源及污染評價發(fā)現(xiàn)，南四湖表層沉積物中As、Hg、Pb、Cd等均超過環(huán)境背景值，在空間上表現(xiàn)出上級湖高、下級湖低的分布特征，各湖區(qū)沉積物污染程度由高至低依次為：南陽湖>獨山湖>微山湖>昭陽湖[4]。2015年對南四湖的南陽湖區(qū)河口與湖心沉積物重金屬潛在生態(tài)危害指數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，南陽湖受Hg及Cd的污染較重，Pb、Cu及Cr為輕微污染[5-6]。2017年對南四湖入湖河流重金屬的風險熵評價結果顯示，鉻、砷和鉛含量的風險較小，南四湖入湖河流水質較好[7]?？梢?，隨著南水北調東線工程的開通和濕地保護和治理力度的加強，南四湖的水質改善顯著，水體和底泥重金屬的含量逐步降低，但是，潛在的重金屬污染問題仍然需要我們長期關注。

生物防護是預防和解決湖水污染的重要方法。湖底淤泥是重金屬蓄積的主要場所。淤泥中的微生物長期處于重金屬的選擇壓力下，對重金屬有較強的富集作用。從湖底淤泥中分離出的抗性微生物在重金屬修復領域具有很大的應用潛力，是進行湖水凈化的重要力量。本研究擬從南四湖底泥中篩選出Pb2+抗性菌株，應用16S rDNA基因測序，結合形態(tài)和生理生化特性確定種類，對這些菌株的適宜生長條件和對Pb2+及其他重金屬離子的抗性進行測試，為南四湖水體重金屬污染的預防和治理提供數(shù)據(jù)支撐[8]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)基

篩選菌株的土壤樣品采自南四湖南陽湖區(qū)表層底泥。

基礎LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物（酵母浸粉）5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL;調節(jié)pH 值至7.0～7.2;1×105 Pa滅菌20 min。

基礎牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：瓊脂10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL;調節(jié)pH值7.0～7.2;1×105 Pa滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)基：將不同重金屬的離子試劑Pb（NO3）2、CoCl2、HgCl2、ZnSO4、CuSO4、Fe2（SO4）3分別加入基礎培養(yǎng)基中，調節(jié)其至相應濃度。

1.2 菌株的分離與篩選

用LB液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別作液體基礎培養(yǎng)基和固體基礎培養(yǎng)基。取各個地點的待測土樣，分別加入到已經(jīng)裝有無菌水的三角瓶中，在磁力攪拌器上攪拌后，使細菌與土樣分離，充分洗脫，靜置后取上清液加入到液體培養(yǎng)基中。在搖床上培養(yǎng)10～12h。取培養(yǎng)液涂布到的固體平板上。稀釋培養(yǎng)液分別至10-1～10-6，共6種不同梯度，每個樣品分別在6個平板培養(yǎng)3～4 d。待菌落長出后，從中選取菌落形態(tài)不同的菌種，菌種編號按照1A、1B、1C、1D等，代表1號樣品中出現(xiàn)的不同菌種。將初篩得到的細菌分別接種到含Pb（NO3）2的平板上進行培養(yǎng)，設定質量濃度梯度，按50、100、150 mg/L……逐漸遞增，經(jīng)過不斷提高鉛離子濃度，確定微生物對Pb2+的喜好質量濃度和耐受限度，選擇抗性最好的菌株進行培養(yǎng)[9]。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學特征觀察 通過劃線法將篩選得到的菌株接種到基礎牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)40～60 h，對菌落形態(tài)及顯微鏡下菌體細胞的形狀進行觀察。

1.3.2 16S rDNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育學分析 提取抗性菌株基因組DNA，使用通用引物27F/1492R擴增16S rDNA基因序列（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行全長測序。將獲得的序列與NCBI和RDP數(shù)據(jù)庫中的現(xiàn)有數(shù)據(jù)進行比對，在數(shù)據(jù)庫中選擇同源性高的序列，使用MEGA 7.0軟件包構建系統(tǒng)發(fā)育樹以來判斷抗性菌種的物種歸屬[10]。

1.4 菌株對其他重金屬離子的耐受性研究

培養(yǎng)菌株，挑單菌落培養(yǎng)于基礎LB液體培養(yǎng)基中，在 30 ℃ 、轉速為120 r/min條件下培養(yǎng)8～10 h后得培養(yǎng)液。將ZnSO4加入10份牛肉膏蛋白胨固體基礎培養(yǎng)基中，使其對應的Zn2+的質量濃度依次為10、20、30、…、90、100 mg/L（每間隔10 mg/L為1個梯度，共10個梯度），同理加入CuSO4、CoCl2、HgCl2、Fe2（SO4）3溶液至牛肉膏蛋白胨固體基礎培養(yǎng)基中。在5種重金屬不同離子濃度的固體培養(yǎng)基上分別涂布0.2 mL菌株培養(yǎng)液，在30 ℃的下培養(yǎng)3～5 d時間，觀察菌落的生長情況[11]。

1.5 菌株吸附Pb2+的條件分析

挑取抗性菌的單菌落，120 r/min、30 ℃，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期;于3 500 r/min離心10 min后，棄去上清，稱量菌體的鮮質量;將離心后的菌體制成一定濃度的定量菌懸液。然后在不同質量濃度的Pb2+的培養(yǎng)基中分別加入 2 mL 菌懸液，在預先設置好的不同條件下吸附后，在 10 000 r/min 條件下離心5 min，上清液用原子吸收分光光度法測定Pb2+濃度（每組做3個重復），設置每組中不加入菌體的組為對照組[12]。按如下公式分別計算菌株對Pb2+的吸附容量q（mg/g）和吸附率Q：

q=（Ci-Cf）/Cb;

（1）

Q=（Ci-Cf）/Ci×100%。

（2）

式中：Ci代表在菌體吸附前的Pb2+的質量濃度，mg/L;Cf代表在菌體吸附后的Pb2+的質量濃度，mg/L;Cb代表吸附劑（菌體）的投加量，g/L，其中，各個數(shù)值均按鮮質量計算。

1.5.1 Pb2+質量濃度對吸附效率的影響 設置恒定條件：轉速160 r/min、pH值6.0、菌量10 g/L，分別控制Pb2+的質量濃度為100～700 mg/L（每間隔100 mg/L為1個梯度，共7個梯度），在溫度30 ℃條件下，振蕩30 min，隨后取上清液，經(jīng)過稀釋后，測定不同條件下上清液中Pb2+質量濃度。

1.5.2 吸附時間對吸附效率的影響 設置恒定條件：轉速 160 r/min、pH值6.0、菌量10 g/L時，Pb2+質量濃度100 mg/L，在溫度30 ℃條件下，分別控制振蕩時間為5～35 min（每間隔 5 min 為1個梯度，共7個梯度），在吸附后取上清液，經(jīng)過稀釋后，測定不同條件下上清液中Pb2+質量濃度。

1.5.3 pH值對吸附效率的影響 設置恒定條件：轉速 160 r/min、菌量10 g/L、Pb2+質量濃度100 mg/L，分別控制pH值至3.0～8.0（每間隔1.0為1個梯度，共6個梯度），在溫度30 ℃條件下，振蕩30 min，取上清液稀釋后測定不同條件下的Pb2+質量濃度。

1.5.4 溫度對吸附的影響 設置恒定條件：轉速160 r/min、pH值6.0、菌量10 g/L、Pb2+質量濃度為100 mg/L，分別控制溫度條件為20～40 ℃（每間隔5 ℃為1個梯度，共5個梯度），振蕩30 min，取上清液稀釋后測定不同條件下的Pb2+質量濃度。

1.5.5 菌體投加量對吸附的影響 設置恒定條件：pH值 6.0、轉速160 r/min、Pb2+質量濃度100 mg/L，控制投加菌量分別為5～35 g/L（每間隔5 g/L為1個梯度，共7個梯度），在溫度30 ℃條件下，振蕩30 min，取上清液稀釋后測定不同條件下的Pb2+質量濃度。

1.5.6 轉速對吸附的影響 設置恒定條件：菌量10 g/L、pH值6.0、Pb2+濃度100 mg/L、控制轉速分別為100～200 r/min（每間隔20 r/min為1個梯度，共6個梯度），在溫度30 ℃條件下，振蕩30 min，取上清液稀釋后測定不同條件下的Pb2+質量濃度[9]。

2 結果與分析

2.1 耐鉛菌株篩選與鑒定

在不斷升高培養(yǎng)基的Pb2+質量濃度后，最終經(jīng)過分離與篩選，得到了能在Pb2+質量濃度最高為700 mg/L培養(yǎng)基中生長的菌株1D，能夠在Pb2+質量濃度最高為600 mg/L培養(yǎng)基中生長的菌株8A。

2.1.1 菌落形態(tài)特征 菌株1D、8A的菌落形態(tài)如圖1、圖2所示，表1為其菌落特征的描述。

2.1.2 菌體形態(tài)、大小、運動性 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株1D的菌體細胞呈直桿狀，菌體粗壯，周生鞭毛或無鞭毛（圖3、圖4），其大小為（1.2～1.6） μm×（3.5～4.6） μm，常單生或呈短鏈狀;菌株8A的菌體細胞呈橢圓形短棒狀，其大小為（0.5～1.5） μm×（1.2～3.0） μm，具圓端，無芽孢，周生鞭毛，運動活潑。

2.1.3 基于16S rDNA基因序列的菌株分類地位確定 菌株1D、8A的16S rDNA基因序列已提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為MK583952、MK583953。通過將測序所得16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)菌株1D與Bacillus cereus（GenBank登錄號HQ317144.1）具有99.86%的同源性，8A菌與Proteus penneri（GenBank登錄號HQ259933.1）具有99.72%的同源性。通過從NCBI下載相關種的16S rDNA序列，應用MEGA 7.0軟件包構建了系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，建樹結果如圖5、圖6所示。

根據(jù)形態(tài)學觀察結果和16S rDNA序列同源性對比分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹可以判斷，菌株1D與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）親緣關系最近，菌株8A與彭氏變形桿菌（Proteus penneri）親緣關系最近。

2.2 抗性菌株的重金屬耐受性分析

2.2.1 對Pb2+的耐受性分析 當固體培養(yǎng)基中Pb2+質量濃度范圍在0～400 mg/L時，1D菌的菌落生長情況較好;隨著Pb2+質量濃度不斷升高，當其質量濃度值超過400 mg/L時，菌株的生長量明顯下降，1D的生長受到抑制;當Pb2+質量濃度繼續(xù)升高，直到升高到700 mg/L時，此時1D的生長幾乎完全受到抑制。當固體培養(yǎng)基中Pb2+質量濃度范圍在0～300 mg/L 時，8A菌的菌落生長情況較好;隨著Pb2+質量濃度不斷升高，當其質量濃度值超過400 mg/L時，菌株的生長量明顯下降，8A的生長受到抑制;當Pb2+質量濃度繼續(xù)升高，直到升高到700 mg/L時，此時8A的生長幾乎完全受到抑制。

2.2.2 對其他重金屬的耐受性分析 采用固體培養(yǎng)基進行菌株對其他重金屬耐受性進行分析，菌株1D、8A對Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+都具有一定程度的耐受濃度，另外2株菌對于Hg2+均無抗性，菌株1D、8A的生長情況見表2、表3。

2.3 吸附條件分析

2.3.1 Pb2+質量濃度對菌株吸附的影響 由圖7可以看出，2種菌株都呈現(xiàn)出了隨著初始的Pb2+質量濃度升高而吸附率下降的趨勢。當Pb2+質量濃度低于一定值時，菌株1D、8A的吸附率變化不明顯，吸附容量仍保持在一定水平;當Pb2+質量濃度不斷增加超出此濃度值時，吸附率則明顯下降，當菌株1D在Pb2+質量濃度升高至700 mg/L時，吸附率僅為36.86%，吸附容量僅為 25.8 mg/g;當菌株8A在Pb2+質量濃度升高至600 mg/L時，菌株8A的吸附率低至10.13%，此時的吸附容量下降至 51.01 mg/g。分析其原因，在較低的初始Pb2+質量濃度條件下，抗性菌株其菌體表面的吸附位點與培養(yǎng)液中的Pb2+之間的相互作用充分，吸附位點的作用效率高，所以有較好的吸附效果;但是伴隨著Pb2+質量濃度的不斷升高，吸附位點與Pb2+之間的作用不斷達到飽和，菌體的Pb2+結合率隨之下降[14-15];此外，也有研究表明，重金屬的質量濃度過高往往會破壞細胞膜，改變膜的通透性[16]，從而影響菌體的吸附作用，最終菌體吸附Pb2+的吸附效果下降。根據(jù)本試驗所得，菌株1D、8A分別在初始的環(huán)境中的Pb2+質量濃度為600、300 mg/L時吸附Pb2+的效率最高。

2.3.2 吸附時間對菌株吸附的影響 由圖8可見，菌株1D，菌株8A在吸附時間為5 min時，其菌株的吸附率已高達91.43%和96.43%，從而可見，菌株的吸附是一個快速的過程。同時，也有有相關試驗表明，菌體在其吸附的最初階段往往速度很快，并且?guī)缀醪幌哪芰縖17]。另外，隨著吸附時間的延長，對于菌株1D吸附Pb2+幾乎沒有影響，但相對菌株1D，菌株8A受吸附時間影響較大，菌株8A在吸附時間為 5 min 時，吸附率達到最大值96.43%。菌株8A在25 min后，隨著時間的增加，吸附率和吸附容量都有一定程度下降，表明菌株8A在吸附過程中還存在著與吸附位點解吸的現(xiàn)象[18]。又因為在25～35 min期間，菌株8A的吸附率下降了38.70%，猜測菌株8A的吸附多為菌體的表面吸附[12，19-20]。

2.3.3 pH值對菌株吸附的影響 在研究pH值對吸附的影響時，考慮到當金屬離子在pH值過高條件下，離子沉淀嚴重，故試驗中設計值pH值<8。pH值對菌體的胞外聚合物（EPS）吸附溶液中的重金屬離子具有極其重要的影響[21]。由圖9可知，pH值對2種菌株吸附Pb2+的影響較為一致，在pH值=3～5時，均呈現(xiàn)隨著pH值的增加吸附率逐漸升高的趨勢。當pH值>5時，菌株1D吸附率隨pH值的增加稍有下降而后又趨于穩(wěn)定;當pH值=7時，菌株8A吸附率達到最大值隨后下降。當溶液pH值較低時，菌體的吸附率伴隨著pH值的增大也隨之增大。因為此時H+的濃度高，大量的H+會與重金屬Pb2+競爭菌體表面的吸附結合位點，從而影響了菌株的吸附性[14]。另外，溶液中的pH值過高同樣不利于細菌的吸附作用，當pH值過高時，Pb2+容易形成其氫氧化物沉淀Pb（OH）2，從而影響吸附效果，使吸附率降低[22]。因此，綜合考慮pH值對Pb2+吸附的影響，菌株1D在試驗中的最適pH值為5，菌株8A的最適pH值為7。

2.3.4 溫度對菌株吸附的影響 圖10中，溫度在對2種菌株吸附Pb2+的影響中呈現(xiàn)出了相反的趨勢，隨著溫度增加，菌株1D的吸附率呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，在35 ℃時達到最大的吸附率97.76%，到40 ℃時，菌株1D吸附率有所降低，吸附容量有所減少。而菌株8A，隨著溫度增加其對Pb2+的吸附能力逐漸下降，在溫度為20 ℃的條件下，菌株8A的吸附率為最大值，此時的菌株8A最大吸附率為95.98%。所以，菌株1D的吸附溫度在35 ℃較為適宜，菌株8A的吸附溫度在20 ℃較為適宜。分析溫度對菌株吸附影響的原因，溫度不僅會影響細菌的代謝，還會對其與金屬離子的結合產(chǎn)生影響，當溫度處于最適溫度時，細菌的代謝為其主動吸附Pb2+的這一過程提供了能量，故有益于吸附效果;在溫度條件不合適時，一方面影響細菌的正常代謝，導致相應的生理功能無法充分發(fā)揮，從而影響了菌體的吸附能力;另外還會對菌體和已經(jīng)與菌體結合的金屬離子兩者之間結合的穩(wěn)定性造成不利的影響[14]。

2.3.5 菌體投加量對菌株吸附的影響 從圖11可見，菌體投加量的增加對于菌株8A對Pb2+的吸附率幾乎沒有影響;對于菌株1D，隨著菌體投加量的不斷增加，對Pb2+的吸附率也是不斷升高，在菌體投加量為30 g/L時，吸附率達到最大值為95.82%，綜合考慮吸附率的變化，菌株1D最佳的菌體加入量為25～30 g/L。對于菌株1D來說，可能在某種限定的金屬離子濃度中，隨著菌體投加量的增大，之前沒有充分吸附完畢的菌體，此時由于個體的增加導致更多的菌體去和金屬離子吸附結合，因而吸附率上升[23]。而菌株8A隨著菌體投加量的增大，吸附率幾乎保持不變?？赡苁怯捎谠谳^低的金屬離子濃度下，8A菌體已經(jīng)與金屬離子充分結合，此時即使再加入更多的菌體，也沒有多余的金屬離子與隨后的菌體結合，所以吸附率不變[24];而后來的菌體則會與先前的菌體產(chǎn)生競爭，彼此阻礙從而導致整體吸附能力下降，這可能是導致菌體8A的吸附率曲線在20 g/L后稍有下降走勢的原因。

2.3.6 轉速對菌株吸附的影響 從圖12中可以看出，菌株1D的吸附率隨著轉速增加呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢，當轉速升高至180 r/min時，其吸附效率達到最高，此時的吸附率是96.77%。菌株8A最初隨著轉速升高吸附率不斷增加，當轉速范圍為120～180 r/min時，菌體8A吸附Pb2+的效果最佳，此時2種菌吸附率高達95.89%～96.87%。另外，2種菌在所設定的轉速升高至180 r/min以上時，菌體的吸附率分別會有不同程度的下降，其中在200 r/min時，菌株1D的吸附率下降更為明顯。這可能與Pb2+吸附傳質速度等原因有關，Pb2+吸附傳質速度因轉速的增大而加快，在一定的轉速范圍內吸附率增加;但當吸附液的轉速過大時，Pb2+傳質速度過快，此時卻難以對Pb2+再進行有效的吸附[25]。菌體吸附不僅有化學吸附還包括物理吸附，包括高轉速造成的靜電吸附，以及金屬離子在高速旋轉下在菌體的表面沉積等[14]。

3 結論與討論

在南四湖底泥采集的土壤中，最終分離篩選出了2株耐鉛菌株，其中菌株1D與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）親緣關系最近，菌株8A與彭氏變形桿菌（Proteus penneri）親緣關系最近。經(jīng)過對它們耐受性與吸附能力的分析，得到菌株1D最大鉛耐受質量濃度為700 mg/L，菌株8A最大鉛耐受質量濃度為600 mg/L。

經(jīng)過吸附性能測試，菌株1D在35 ℃、pH值=5、Pb2+質量濃度為100 mg/L、菌體投放量為30 g/L、轉速為180 r/min、吸附時間為15 min時吸附效率最高，吸附Pb2+的效果最好;菌株8A在20 ℃、pH值=7、Pb2+質量濃度為300 mg/L、菌體投放量為 20 g/L、轉速為180 r/min、吸附時間為5 min時吸附效率最高，吸附Pb2+的效果最好。

另外在菌株對其他重金屬的耐受性分析中，菌株1D對Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+的耐受質量濃度分別為40、80、40、90 mg/L，菌株8A對Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+的耐受質量濃度分別為30、80、40、90 mg/L，且2株菌對于Hg2+均無抗性。

土壤或湖泊底泥中的細菌，往往具有種類豐富、繁殖周期短、在短時間內可以獲得大量豐富菌體的特點[26-27]，應該重視細菌等微生物對重金屬離子的吸附作用[28]，從而利用篩選到的對特定重金屬存在抗性的菌種來有效防治受重金屬污染的土壤。本試驗中，最終篩選到的菌株抗鉛性能高、對鉛離子的吸附性好，豐富了重金屬污染土壤微生物修復的生物資源庫，同時對于吸附特性的研究又可以為抗重金屬菌株特別是抗鉛菌株的篩選提供參考及理論依據(jù)[29]。

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