牛肝菌多糖的提取及抗氧化性研究

鄧加聰，曾銹華，陳 婕，郭婷婷，王志輝，鄭 虹，2

（1.福建師范大學(xué)福清分校 海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300；2.近海流域環(huán)境測控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福清 350300；3.現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高等學(xué)校工程研究中心，福建 福清 350300）

牛肝菌（Boletus）是一種藥、食兼用的野生珍稀食用菌。它富含多糖、多酚、多種維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等人體需要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有降血脂、抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)、抗氧化等功效[1-5]。

當(dāng)前牛肝菌為我國菌類產(chǎn)品出口創(chuàng)匯作出了重要貢獻(xiàn)，并且牛肝菌作為一種未被完全開發(fā)的高營養(yǎng)的美味食用菌類，對其藥用及營養(yǎng)價(jià)值的研究將對更深一步開發(fā)牛肝菌資源有著十分重要的理論意義。近年來，牛肝菌的研究主要集中在其的營養(yǎng)成分含量[6-8]、多糖的提取工藝[9-10]及抗氧化作用[11]。常用的提取多糖方法有熱水浸提法、微波提取法、泡沫分離法等[12-14]。目前報(bào)道較多的是熱水浸提法，微波提取牛肝菌多糖的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化云南牛肝菌多糖提取工藝，并利用1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和羥基自由基（·OH）清除能力測定法對其抗氧化性進(jìn)行了測定[15-16]。以期為牛肝菌食物資源的開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑

牛肝菌粉末：云南；無水氯化鈣、乙醇、葡萄糖、苯酚（重蒸餾）、硫酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、DPPH（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250E超聲波清洗器：昆山市超聲儀有限公司；TDL-4低速離心機(jī)：福州精儀儀器有限公司；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；T22SP分光光度計(jì)：上海棱光儀器有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛肝菌粗多糖的提取方法

稱取一定量牛肝菌子實(shí)體粉末，以水為提取液，按一定的料液比，在一定溫度條件下超聲一定時(shí)間后，4 000 r/min離心10 min，收集上清液；上清液用氯化鈣法去除蛋白[17-18]，4 000 r/min離心10 min，收集上清液；上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來體積的1/3，加入4倍體積體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇過夜沉淀；4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，沉淀于60 ℃干燥得牛肝菌粗多糖。

1.3.2 牛肝菌粗多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

料液比對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取2 g牛肝菌粉末，控制超聲時(shí)間為1 h、超聲溫度為60 ℃、超聲波功率為400 W，分別在不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））條件下進(jìn)行超聲波浸提試驗(yàn)，考察牛肝菌多糖在不同料液比條件的提取效果。

超聲時(shí)間對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取牛肝菌粉末2 g，料液比為1∶20（g∶mL），在超聲溫度為60 ℃、超聲功率為400 W的條件下，超聲不同時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），考察牛肝菌多糖在不同超聲時(shí)間下的提取效果。

超聲溫度對牛肝菌粗多糖提取的影響：稱取牛肝菌粉末2 g，料液比為1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間為0.5 h，超聲功率為400 W的條件下，在不同超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）條件下進(jìn)行超聲，考察牛肝菌多糖在不同超聲溫度條件下的提取效果。

1.3.3 牛肝菌粗多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲浸提過程的工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 牛肝菌粗多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for crude polysaccharide extraction conditions optimization from Boletus

1.3.4 測定方法

牛肝菌多糖含量：采用苯酚-硫酸法[19-20]進(jìn)行測定。多糖得率計(jì)算公式如下：

1.3.5 牛肝菌粗多糖抗氧化性的測定

（1）DPPH自由基（DPPH·）清除能力：參照參考文獻(xiàn)[21-22]的方法進(jìn)行測定。

總之，口語交際活動(dòng)都發(fā)生在一定的語境中。在教學(xué)中，我們要利用一切可以利用的資源，創(chuàng)設(shè)與教學(xué)內(nèi)容相關(guān)的語境，這樣更容易激發(fā)學(xué)生內(nèi)在的動(dòng)力，提高學(xué)習(xí)效果。但也有一點(diǎn)是值得注意的，語境的創(chuàng)設(shè)應(yīng)盡量避免人為創(chuàng)設(shè)帶來的造作的不真實(shí)感，真正達(dá)到較好的教學(xué)效果。

取不同質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL）的牛肝菌多糖溶液2 mL；添加2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L），振蕩搖勻后，暗處、室溫條件下靜置30 min，在波長517 nm處測其吸光度值（A1），同時(shí)以2 mL不同濃度的多糖與2 mL無水乙醇混勻后，在波長517 nm處測得吸光度值（A2）；以無水乙醇為空白，測得吸光度值（A0）；以不同質(zhì)量濃度（0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL）的抗壞血酸（vitamin C，VC）水溶液為對照。每個(gè)樣品溶液進(jìn)行3個(gè)平行。清除率按公式（1）計(jì)算。

（2）·OH清除率：參照參考文獻(xiàn)[23-24]的方法進(jìn)行測定。

取不同質(zhì)量濃度（2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10 mg/mL）的牛肝菌多糖溶液1 mL于試管中，加入1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）和1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），再加入1 mL的H2O2溶液（8.8 mmol/L），37 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，6 000 r/min離心10 min，在波長510 nm處測定吸光度值（A1），同時(shí)以蒸餾水代替H2O2溶液，其他條件不變，測定吸光度值（A2）；以不加多糖的蒸餾水為空白組，測定吸光度值（A0）；以不同質(zhì)量濃度（0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL）的抗壞血酸（VC）水溶液為對照。每個(gè)樣品溶液進(jìn)行3個(gè)平行。清除率按公式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肝菌粗多糖提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖1 料液比對牛肝菌多糖得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polysaccharide yield from Boletus

由圖1可見，牛肝菌多糖得率隨著料液比中用水量的增大而逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)，多糖得率最高，為21%；而料液比為1∶25～1∶35（g∶mL）時(shí)，多糖得率反而有所降低，說明適宜的料液比有利于多糖的浸出，料液比過低，多糖浸出不完全，導(dǎo)致多糖得率較低，料液比過高，不利于后期的蒸餾濃縮。因此，選擇最適料液比為1∶20（g∶mL）。

2.1.2 超聲時(shí)間對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖2 超聲時(shí)間對牛肝菌多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield from Boletus

由圖2可見，牛肝菌多糖得率隨著超聲時(shí)間的延長呈先增后降的趨勢。在超聲時(shí)間為0.5～2.0 h時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，多糖得率逐漸增大；當(dāng)超聲時(shí)間為2.0 h時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，為19.76%；之后，牛肝菌多糖得率隨著超聲時(shí)間的延長逐漸降低。這可能是由于超聲波的機(jī)械剪切作用過度，導(dǎo)致部分多糖被降解，從而使多糖得率下降[11]。因此，選擇最適超聲時(shí)間為2.0 h。

2.1.3 超聲溫度對牛肝菌多糖提取效果的影響

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield from Boletus

2.2 牛肝菌多糖提取的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

表2 牛肝菌粗多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction conditions optimization of polysaccharide from Boletus

由表2可知，牛肝菌粗多糖得率受各因素影響的次序?yàn)锳＞B＞C，即料液比對粗多糖得率的影響最大，超聲溫度次之，超聲時(shí)間最小。最佳工藝組合為A1B2C2，即料液比為1∶15（g∶mL），超聲時(shí)間為2 h，超聲溫度為60 ℃，在此條件下，牛肝菌的多糖得率為41.76%。

2.3 牛肝菌粗多糖對DPPH·和·OH的清除作用

圖4 牛肝菌粗多糖對DPPH·（a）和·OH（b）的清除效果Fig.4 Scavenging effect of crude polysaccharides of Boletus on DPPH·(a) and·OH (b)

由圖4（a）可見，VC和牛肝菌多糖的濃度對DPPH·清除率具有顯著影響。當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其DPPH·清除率已達(dá)100%；與VC相比，牛肝菌多糖質(zhì)量濃度為0.752 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率為50%；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，多糖對DPPH·的清除率可達(dá)71.19%。多糖對DPPH·的半抑制濃度（half maximal inhibition concentration，IC50）為0.75mg/mL。

由圖4（b）可見，VC對·OH具有很強(qiáng)的清除能力。當(dāng)VC質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，清除效果已經(jīng)達(dá)到100%。與VC相比，牛肝菌多糖對·OH清除作用較差。當(dāng)牛肝菌多糖質(zhì)量濃度為5.12 mg/mL時(shí)，多糖對·OH的清除率為50%；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，多糖對·OH的清除率可達(dá)80.69%。多糖對·OH的IC50值為5.12mg/mL。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)，獲得超聲波浸提牛肝菌多糖的最佳工藝組合為A1B2C2，即料液比為1∶15（g∶mL），超聲時(shí)間為2 h，超聲溫度為60 ℃，在此條件下，牛肝菌的多糖得率為41.76%。與VC相比，多糖對DPPH·和·OH的清除能力存在一定的差異，多糖對DPPH·和·OH的IC50值分別為0.75mg/mL和5.12mg/mL，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度分別為1.00 mg/mL和10.00 mg/mL時(shí)，多糖對DPPH·和·OH的清除率分別為71.19%和80.69%。