聶吉語(yǔ)，李 榮,*，王 穎，湯書華，譚 津，包 榮，姜子濤,2,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700）

生物堿是一類于植物體內(nèi)廣泛存在的含氮雜環(huán)的堿性天然有機(jī)物，其中絕大部分具有重要的醫(yī)療價(jià)值[1-5]?？煽蓧A、茶堿和咖啡堿是天然甲基黃嘌呤類生物堿，具有能夠使中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和骨骼肌興奮，血管達(dá)到舒張狀態(tài)、平滑肌得到松弛和利尿等生理作用[6]。三者母體結(jié)構(gòu)相同，但甲基取代基的位置和數(shù)目存在差異?？煽蓧A與茶堿分別為3,7位和1,3位的二甲基取代，二者為同分異構(gòu)體，而咖啡堿為1,3,7位的三甲基取代。作為一類具有顯著生物活性作用的生物堿，可可堿、茶堿和咖啡堿普遍存在于茶葉、咖啡、可可和糖果等食品中[7-8]。近年來(lái)，其制品在食品工業(yè)中更是得到了廣泛應(yīng)用，并且國(guó)標(biāo)中明確規(guī)定咖啡堿可用于可樂(lè)型飲料。但如果對(duì)以上3 種物質(zhì)的攝入量未加控制而過(guò)量食用，則會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用[9-11]，因此建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)可可堿、茶堿和咖啡堿的方法非常必要。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法是測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的最常用的方法[12-14]，檢測(cè)一般采用C18反相色譜柱[15-18]。王增盛[19]采用μ Bondapak C18柱，以N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸溶液為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定了茶葉中的咖啡堿、茶堿和可可堿的含量；梁燕妮[20]采用C18柱，以甲醇和水為流動(dòng)相，梯度洗脫測(cè)定了不同廠家六堡茶中可可堿、茶堿、咖啡堿的含量；劉志彬等[21]采用Symmetry C18柱，以乙腈和乙酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫測(cè)定了10 種典型武夷巖茶葉片及沖泡茶湯中可可堿、茶堿和咖啡堿的含量；陳靜等[22]采用Unitary C18柱，以甲醇和0.5%甲酸溶液為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定了可可堿和咖啡堿的含量。

以上報(bào)道中雖可同時(shí)檢測(cè)1～3 種生物堿，但流動(dòng)相條件復(fù)雜，含有酸或鹽且需要調(diào)節(jié)pH值，以及需要梯度洗脫等。這些分離分析方法均建立在以硅膠為基質(zhì)的色譜柱基礎(chǔ)上，其游離的硅羥基會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附，可可堿、茶堿和咖啡堿等一些極性較強(qiáng)的生物堿色譜峰會(huì)嚴(yán)重拖尾，甚至?xí)驈?qiáng)吸附而不能洗脫[23]，從而使分離效率降低，同時(shí)使色譜柱的使用壽命大幅縮短。而作為近年發(fā)展起來(lái)的新型色譜填料，鈦膠基質(zhì)固定相既可以作為L(zhǎng)ewis酸，也可以作為L(zhǎng)ewis堿，較傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)固定相優(yōu)勢(shì)明顯。并且其不存在硅膠固定相的“第2效應(yīng)”，同時(shí)在pH 1～14范圍內(nèi)均非常穩(wěn)定，對(duì)生物樣品中帶有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)還具有特殊的吸附能力，分離選擇性也很高，而硅膠固定相則僅適用于pH 3～9的范圍內(nèi)。

本實(shí)驗(yàn)采用鈦膠基質(zhì)色譜固定相建立的反相HPLC可同時(shí)分離，分析結(jié)構(gòu)相似的3 種生物堿——可可堿、茶堿和咖啡堿，該法流動(dòng)相成分簡(jiǎn)單且不含鹽，僅為5%甲醇溶液，且采用等度洗脫，檢測(cè)效率高、分離靈敏度高、檢出限低、穩(wěn)定性好。將此法應(yīng)用于6 種飲料樣品中可可堿、茶堿和咖啡堿的測(cè)定，在重復(fù)性、回收率等方面均表現(xiàn)優(yōu)異，結(jié)果令人滿意。另外，本實(shí)驗(yàn)也研究了3 種生物堿保留的熵、焓和吉布斯自由能，從熱力學(xué)的角度探討3 種生物堿在HPLC上的保留行為。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可堿標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（99%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；6 種飲料樣品 市購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

1200系列HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司；Sachtopore-RP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?） 美國(guó)Zirchrom公司；Lambda 25紫外-可見分光光度計(jì) 珀金埃爾默儀器有限公司；H2050R-1離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AUY120萬(wàn)分之一天平 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.0 mg/mL可可堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g可可堿標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中；2.0 mg/mL茶堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g茶堿標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至50 mL容量瓶中；3.0 mg/mL咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.150 0 g咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至50 mL容量瓶中，以上各儲(chǔ)備液均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品處理

飲料樣品：準(zhǔn)確量取5 mL已提前超聲脫氣20 min的樣品，稀釋2 倍，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC分析。固體飲料樣品：準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，在60 ℃條件下采用超聲波提取30 min，隨后在4 000 r/min條件下離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相為水-甲醇（95∶5，V/V），等梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm；柱溫60 ℃。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將可可堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至500、100、50、20、10 μg/mL和5

μg/mL，茶堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至1 000、500、100、50、20、10 μg/mL和5 μg/mL，咖啡堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至1 200、600、120、60、24、12 μg/mL和6 μg/mL，取20 μL進(jìn)行HPLC分析，以各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液由上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液以相似水平配制而成，質(zhì)量濃度由低到高依次編號(hào)為1～7。

1.3.5 熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23-25]，并按照1.3.3節(jié)色譜條件分別在30、45、50、55 ℃和60 ℃測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的熱力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相中甲醇比例的確定

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液的HPLC圖Fig. 1 HPLC profiles with different proportions of methanol in mobile phase

本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相僅為甲醇和水，配制甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為3%、5%、8%、10%和20%，按照1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，如圖1所示。隨著流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，流動(dòng)相的極性變小，可可堿、茶堿和咖啡堿的保留時(shí)間也逐漸減小。保留時(shí)間短，雖然能夠使分析速度加快，但3 種生物堿的分離效果也會(huì)發(fā)生比較大的變化。當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為8%和10%時(shí)，可可堿和茶堿的分離度減少，當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，可可堿、茶堿和咖啡堿三者已經(jīng)不能實(shí)現(xiàn)完全分離。且它們的保留時(shí)間僅有4 min左右，較短的保留時(shí)間容易造成樣品制備過(guò)程中的雜質(zhì)、保留較弱的非極性或弱極性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。但當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，僅為3%時(shí)，咖啡堿的保留時(shí)間與前兩者相比又過(guò)長(zhǎng)，浪費(fèi)分離時(shí)間，且存在溶質(zhì)峰展寬的現(xiàn)象。因此，最終選擇流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為5%，可達(dá)到各物質(zhì)在基線分離的情況下，保留時(shí)間相對(duì)較短。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柱效的影響Fig. 2 Effect of methanol proportion in mobile phase on number of plates

隨著流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，半峰寬也隨之減小（圖1），在同一保留時(shí)間下，半峰寬越小，柱效越高[26-27]。如圖2所示，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，3 種堿的柱效也隨之增大；在同一甲醇體積分?jǐn)?shù)下，柱效由大到小為茶堿＞咖啡堿＞可可堿。

2.2 柱溫的影響

2.2.1 柱溫的選擇

圖3 不同柱溫HPLC圖Fig. 3 HPLC profiles at different column temperatures

按照1.3.3節(jié)色譜條件，分別調(diào)節(jié)柱溫為30、45、50、55 ℃和60 ℃進(jìn)樣分析，如圖3所示。柱溫對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿3 種物質(zhì)的保留時(shí)間和分離度也有較大的影響，但柱溫對(duì)三者的影響稍低于流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)的影響。隨著柱溫的升高，3 種物質(zhì)的保留時(shí)間也越來(lái)越小，可可堿和茶堿的保留時(shí)間減小幅度不大，咖啡堿的保留時(shí)間減少明顯，說(shuō)明它們?cè)阝伳z反相色譜柱上的保留過(guò)程是放熱的，且熱效應(yīng)也有所不同。同時(shí)，增加柱溫可以減小柱壓，峰形變好，在60 ℃以上，鈦膠柱更能發(fā)揮其優(yōu)良的色譜性能，然而甲醇的沸點(diǎn)（64.5 ℃）限制本研究最終選擇柱溫為60 ℃而不宜更高。

圖4 柱溫對(duì)柱效的影響Fig. 4 Effect of column temperature on number of plates

隨著柱溫的升高，可可堿、茶堿和咖啡堿的半峰寬呈減小趨勢(shì)，表明柱效不斷提高。如圖4所示，隨著柱溫的升高，3 種堿的柱效也隨之增大；在同一柱溫下，柱效由大到小為茶堿＞咖啡堿＞可可堿。

2.2.2 熱力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

圖5 不同柱溫可可堿、茶堿和咖啡堿的Van’t Hoff曲線Fig. 5 Van’t Hoff plots for theobromine, theophylline and caffeine at different column temperatures

表1 可可堿、茶堿和咖啡堿的回歸參數(shù)Table 1 Regression parameters for theobromine, theophylline and caffeine

按照1.3.5節(jié)方法在30～60 ℃條件下對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿進(jìn)行分析，如圖5和表1、2所示。由圖5和表1可知，在不同溫度下，可可堿、茶堿和咖啡堿在鈦膠色譜柱上的分離效果呈現(xiàn)良好線性，表明在本實(shí)驗(yàn)所選定的溫度范圍內(nèi)其在鈦膠柱上具有一致的分離機(jī)制。

表2 可可堿、茶堿和咖啡堿在333.15 K的熵、焓和吉布斯自由能Table 2 Standard entropy (ΔS0), enthalpy (ΔH0) and Gibbs free energy(ΔG0) of theobromine, theophylline and caffeine at 333.15 K

鈦膠色譜柱對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿的分離是由ΔG0決定的，而ΔG0又與ΔH0和ΔS0有關(guān)。由表2可知，3 種生物堿的ΔH0和ΔS0均為負(fù)值，又根據(jù)文獻(xiàn)[25]可知：當(dāng)ΔG0為正值時(shí)，表明主要由ΔS0來(lái)驅(qū)動(dòng)分析物的保留行為；當(dāng)ΔG0為負(fù)值時(shí)，說(shuō)明此時(shí)ΔH0在它們的保留行為中起主要作用。

熵代表了體系的混亂程度，當(dāng)分析物被固定相吸附時(shí)體系混亂度較小，因?yàn)榇藭r(shí)被吸附的物質(zhì)傾向于較整齊的排列；而當(dāng)分析物從固定相上解吸下來(lái)時(shí)，此時(shí)被吸附的物質(zhì)趨向于做雜亂無(wú)章的布朗運(yùn)動(dòng)，因此體系混亂度增大[28]。由表2可以看出，3 種生物堿吸附與解吸的總熵變?chǔ)0為負(fù)值，并且ΔS0的順序?yàn)椴鑹A＜可可堿＜咖啡堿，說(shuō)明在解吸過(guò)程中茶堿的混亂度減少最多導(dǎo)致其最不易被解吸，從熵變角度表明茶堿的吸附能力最強(qiáng)，咖啡堿的吸附能力最弱，保留順序?yàn)榭Х葔A、可可堿、茶堿。

焓代表了體系的熱效應(yīng)，當(dāng)體系為吸熱過(guò)程，焓值升高；當(dāng)體系為放熱過(guò)程，焓值降低。由表2可以看出，3 種生物堿的總焓變?chǔ)0為負(fù)值，說(shuō)明溶質(zhì)在HPLC中的保留過(guò)程為放熱過(guò)程[29-30]，即吸附的貢獻(xiàn)大于解吸的貢獻(xiàn)，并且ΔH0的順序?yàn)榭Х葔A＜茶堿＜可可堿，從焓變角度表明咖啡堿的吸附能力最強(qiáng)，可可堿的吸附能力最弱，保留順序?yàn)榭煽蓧A、茶堿和咖啡堿。

當(dāng)分析物從流動(dòng)相進(jìn)入固定相為熱力學(xué)自發(fā)過(guò)程時(shí)ΔG0為負(fù)值，ΔG0越小，表明分析物越容易從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相中，即分析物在固定相上的保留會(huì)相對(duì)更強(qiáng)。可可堿、茶堿和咖啡堿的ΔG0均為負(fù)值，且依次減小，即咖啡堿在固定相中保留最強(qiáng)，茶堿次之，可可堿保留最弱，這也說(shuō)明3 種堿在鈦膠固定相中的保留行為是由焓變?chǔ)0驅(qū)動(dòng)的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明焓變的數(shù)值遠(yuǎn)大于熵變的數(shù)值，從熱力學(xué)角度闡明了分析物的保留機(jī)理。

2.3 流速的選擇

考察流速分別為0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min和1.4 mL/min時(shí)的影響，按照方法1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，如圖6所示。流動(dòng)相的流速對(duì)化合物的保留時(shí)間有較大影響。隨著流速的增大，可可堿、茶堿和咖啡堿的色譜峰前移，保留時(shí)間均縮短，同時(shí)其半峰寬也變小。而對(duì)于分離度而言，在5 種流速下，3 種生物堿均達(dá)到了完全分離，即分離度大于1.5。當(dāng)流速小于1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；但當(dāng)流速達(dá)到1.2 mL/min特別是1.4 mL/min時(shí)，可可堿的保留時(shí)間偏小，同時(shí)在增大流速時(shí)會(huì)導(dǎo)致柱壓明顯增加，從而大大降低色譜柱的使用壽命，不利于色譜儀的正常使用。因此，流動(dòng)相的流速最終確定為1.0 mL/min。

圖6 不同流速HPLC圖Fig. 6 HPLC pro fi les at different flow rates

圖7 流速對(duì)柱效的影響Fig. 7 Effect of flow rate on number of plates

同樣，在流速不斷增大的情況下，理論塔板數(shù)也不斷升高，即柱效呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。如圖7所示，在同一流速下，柱效由大到小為茶堿＞咖啡堿＞可可堿（1.4 mL/min除外）；在流速為1.4 mL/min時(shí)，可可堿和咖啡堿的柱效幾乎一致。

綜合考慮以上因素，最終確定HPLC分離分析可可堿、茶堿和咖啡堿的最佳條件為流動(dòng)相水-甲醇（95∶5，V/V），柱溫60 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，在此條件下三者混標(biāo)與單標(biāo)的HPLC圖見圖8。

圖8 可可堿、茶堿和咖啡堿的HPLC圖Fig. 8 HPLC profiles of theobromine, theophylline and caffeine

2.4 檢出限及線性范圍結(jié)果

按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定可可堿、茶堿和咖啡堿的線性范圍。結(jié)果顯示，可可堿、茶堿和咖啡堿三者分別在質(zhì)量濃度范圍為5～500、5～1 000 μg/mL和6～1 200 μg/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表3所示。

表3 可可堿、茶堿和咖啡堿的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients and LODs of theobromine, theophylline and caffeine

2.5 方法精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

從1.3.4節(jié)中選取3號(hào)和4號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在最優(yōu)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣9 次，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即精密度小于0.23%。將可可堿、茶堿和咖啡堿加入需要測(cè)定的6 個(gè)飲料樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，如表4所示，6 種樣品的色譜圖見圖9。由表4可知，可可堿、茶堿和咖啡堿的回收率范圍分別為99.0%～102.0%、96.7%～106.7%和99.4%～102.3%。由圖9可知，本法可實(shí)現(xiàn)對(duì)可可堿、茶堿和咖啡堿的同時(shí)分離檢測(cè)。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和回收率Table 4 Results and recoveries

圖9 樣品HPLC圖Fig. 9 HPLC profiles of samples

3 結(jié) 論

鈦膠基質(zhì)色譜固定相在天然甲基嘌呤類生物堿如可可堿、茶堿和咖啡堿的快速、同時(shí)分析檢測(cè)中展現(xiàn)出了優(yōu)異的色譜性能，檢測(cè)結(jié)果顯示色譜峰峰形較好，可達(dá)到理想的測(cè)定效果，且其在線性范圍、檢出限以及加標(biāo)回收率等方面均可達(dá)到分析要求。此外，HPLC條件（尤其是流動(dòng)相）在較大程度上影響化合物的分離，流動(dòng)相的試劑種類、梯度比例以及酸溶液的種類和濃度均可影響分離效果。在本實(shí)驗(yàn)提出的色譜條件中，流動(dòng)相中甲醇的比例僅占5%，無(wú)需添加任何緩沖鹽，采用等度洗脫簡(jiǎn)便、快速。同時(shí)，可以避免堿性物質(zhì)的不可逆吸附以及色譜柱的壽命隨使用而快速縮短等弊端，充分體現(xiàn)了綠色高效、保護(hù)環(huán)境、節(jié)約資源等優(yōu)點(diǎn)，適于推廣普及。