楊金泉，賀小敏,*，施敏芳，陳 浩，李永蓉，朱友林

（1.湖北省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，湖北 武漢 430072；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.長(zhǎng)江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430100）

雙酚A（bisphenol A，BPA）是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，主要用于生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹(shù)脂、聚砜樹(shù)脂等多種高分子材料，在食品包裝和容器內(nèi)壁涂裝等方面應(yīng)用廣泛，在食品的加工、運(yùn)輸、貯藏等過(guò)程中很容易遷移至食品中[1]。近年研究表明，BPA是一種外源性環(huán)境激素，具有擬雌激素活性，微量甚至痕量濃度的量也可能對(duì)動(dòng)物生理狀況、生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響[2]，含有BPA的塑料嬰兒奶瓶在美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)家已禁止使用和銷(xiāo)售[3]。目前，人們常用雙酚S（bisphenol S，BPS）作為BPA的替代品[4]，它是BPA分子中的丙烷基被砜基取代而得到的衍生物（圖1），但有研究表明BPS具有與BPA類(lèi)似的生物毒性，同樣能對(duì)生物體產(chǎn)生雌性激素影響，也是一種內(nèi)分泌干擾素[5]。GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[6]規(guī)定飲用水BPA不得大于0.01 mg/L；GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]規(guī)定涂層中BPS的限定值，要求其特定遷移量不得超過(guò)0.05 mg/kg。但目前我國(guó)還沒(méi)有飲用水中BPA、BPS標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，因此，建立靈敏高效的BPA和BPS分析方法具有重要意義。

圖1 BPA（A）和BPS（B）的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of BPA (A) and BPS (B)

由于飲用水中BPA和BPS含量通常較低，需要采用液液萃取[8-9]、固相萃取[10-12]和固相微萃取[13-14]等前處理方法進(jìn)行富集，然后通過(guò)氣相色譜[15]、液相色譜[16-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18-20]或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[21-24]等儀器進(jìn)行測(cè)定。液相色譜定性不夠準(zhǔn)確、易產(chǎn)生假陽(yáng)性，且靈敏度較低；氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定BPA和BPS往往需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定性準(zhǔn)確、靈敏度高、無(wú)需繁瑣的衍生化，在雙酚類(lèi)環(huán)境激素的分析中應(yīng)用越來(lái)越多。目前，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定BPA的研究較多，但對(duì)BPS的檢測(cè)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飲用水中BPA和BPS的定量分析方法，并對(duì)湖北省內(nèi)6 處飲用水源地水樣展開(kāi)應(yīng)用分析，為飲用水中BPA和BPS的科學(xué)管控提供可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BPA、BPS（純度＞98%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；氟化銨（色譜純） 美國(guó)Fluka公司；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL） 美國(guó)Waters公司；0.22 μm微孔濾膜；水為Milli-Q超純水；高純氮?dú)?9.999%。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀、6460三重四極桿質(zhì)譜儀（配置電噴霧電離源、ZORBAX Extend-C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）） 美國(guó)Agilent公司；VisiprepTMDL 12孔固相萃取裝置（配有真空泵和虹吸管） 美國(guó)Supelco公司；TurboVap LV氮吹儀美國(guó)Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 0 g BPA和BPS標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100 mL，4 ℃避光保存。

工作曲線的配制：準(zhǔn)確移取BPA和BPS標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，再以甲醇-水溶液（1∶1，V∶V）逐級(jí)稀釋為不同質(zhì)量濃度梯度（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品采集和保存

在湖北省武漢（3 個(gè)水廠）、黃石（1 個(gè)水廠）、孝感（1 個(gè)水廠）、咸寧（1 個(gè)水庫(kù)）地市6 個(gè)飲用水源地共設(shè)置12 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)位，采集入水口和出水口樣品。樣品采集和保存參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5750.2—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集和保存》，使用預(yù)先洗凈烘干的棕色玻璃瓶保存樣品，避光于4 ℃冷藏，在7 d內(nèi)萃取，萃取后的樣品應(yīng)避光于4 ℃冷藏，40 d內(nèi)分析完畢。

1.3.3 樣品前處理

依次用10 mL甲醇和10 mL超純水對(duì)HLB固相萃取柱進(jìn)行活化，備用。量取500 mL水樣以3～5 mL/min的流速通過(guò)活化后的HLB小柱，然后用10 mL 10%甲醇溶液淋洗固相萃取小柱后繼續(xù)抽吸1 h。用10 mL純甲醇以1 mL/min的流速洗脫，洗脫液于37 ℃恒溫水浴并用氮?dú)鉂饪s至0.5 mL，然后以超純水定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

在分析樣品的同時(shí)做全程序空白實(shí)驗(yàn)，即按照上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程以超純水代替水樣完成全部分析流程，檢查分析過(guò)程中是否存在污染。

1.3.4 儀器工作條件

1.3.4.1 色譜條件

流動(dòng)相為1 mmol/L氟化銨溶液（A）和乙腈（B）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1，后運(yùn)行3 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of ultra performance liquid chromatography

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離負(fù)離子模式，監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣流速11 L/min，霧化器壓力45 psi，毛細(xì)管電壓3 500 V。質(zhì)譜MRM模式參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 BPA和BPS的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for BPA and BPS

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法檢出限依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)HJ 168—2010《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》，按照樣品分析的全部步驟，對(duì)低質(zhì)量濃度加標(biāo)樣品進(jìn)行不少于7 次平行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法檢出限。

分別取500 mL空白樣品，添加低、中、高3 個(gè)水平的BPA和BPS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）和加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算最大值、最小值、平均值和RSD，并根據(jù)化合物的響應(yīng)值或回收率數(shù)據(jù)作出相應(yīng)色譜圖、柱形圖等圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別將1 mg/L BPA和BPS標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。先通過(guò)全掃描確定化合物的母離子和正負(fù)離子采集模式，再進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)優(yōu)化其碎裂電壓及毛細(xì)管電壓使母離子的響應(yīng)最大，然后對(duì)母離子做子離子全掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較高的2 個(gè)特征碎片離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最大，最后得到該化合物的2 個(gè)MRM離子對(duì)及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)（表2）。在該條件下獲得的BPA和BPS標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖如圖2所示。BPA和BPS均在負(fù)離子模式采集時(shí)響應(yīng)較高。這主要是由于BPA和BPS均含有酚羥基，易失去一個(gè)H＋產(chǎn)生[M-H]-母離子，即負(fù)離子模式。

圖2 BPA（A）和BPS（B）標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式色譜圖Fig. 2 Multi-reaction monitoring chromatograms for BPA (A) and BPS (B) in a standard solution

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

圖3 不同流動(dòng)相下BPA和BPS的響應(yīng)值比較Fig. 3 Comparison of responses for BPA and BPS in different mobile phases

考察BPA和BPS在酸性、中性、堿性及不同緩沖鹽流動(dòng)相條件下的分離效果和響應(yīng)值大小。因甲酸、氨水、醋酸銨、氟化銨等化合物揮發(fā)性較強(qiáng)，不易在色譜柱和質(zhì)譜中殘留，實(shí)驗(yàn)主要采用以上幾種化合物調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值和離子強(qiáng)度，對(duì)比不同濃度的氨水-乙腈、水-乙腈、甲酸-乙腈、醋酸銨-乙腈、氟化銨-乙腈等作為流動(dòng)相時(shí)，BPA和BPS的響應(yīng)值大小，如圖3所示。結(jié)果表明：這2 種雙酚類(lèi)物質(zhì)均在氟化銨-乙腈條件下響應(yīng)值最高，峰形最好。進(jìn)一步考察不同濃度（0.5、1 mmol/L和2 mmol/L）氟化銨-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)BPA和BPS響應(yīng)值的影響。結(jié)果顯示，隨著氟化銨濃度增大，兩種雙酚類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)值均有所增加，2 mmol/L氟化銨與1 mmol/L氟化銨時(shí)，其響應(yīng)情況相當(dāng)，考慮到氟化銨有一定的腐蝕性，濃度過(guò)大可能對(duì)色譜柱有一定的損害，故最終確定1 mmol/L氟化銨溶液-乙腈為流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

由于BPA和BPS屬弱極性化合物，通常采用C18柱、HLB柱等反相柱對(duì)其進(jìn)行富集，實(shí)驗(yàn)比較了相同規(guī)格的C18、HLB、NH2固相萃取柱對(duì)BPA和BPS的回收率情況（圖4）。結(jié)果表明，NH2柱對(duì)BPA和BPS的富集效果很差，尤其是對(duì)BPA基本無(wú)保留；C18柱對(duì)兩種物質(zhì)的保留能力一般，回收率低于62%；而HLB柱對(duì)各目標(biāo)物的保留能力相對(duì)較好，回收率分別為85%和97%。這可能是由于BPA和BPS極性偏強(qiáng)，但電離程度弱，主要呈分子形態(tài)，不適宜采用NH2柱這類(lèi)離子交換型填料，而C18柱更適合富集非極性化合物，萃取原理為疏水效應(yīng)。相比較而言，HLB柱中的填料是一種親水親脂型聚合物，可富集的化合物極性范圍較寬，因此HLB柱對(duì)BPA和BPS均有較好的萃取效果。

圖4 不同固相萃取柱對(duì)BPA和BPS回收率的比較Fig. 4 Comparison of recoveries for BPA and BPS on different SPE columns

2.2.2 淋洗液的選擇

為去除基質(zhì)干擾，可在洗脫前對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行淋洗，通常在淋洗液中添加一定比例的甲醇，去除部分強(qiáng)極性或水溶性雜質(zhì)，但同時(shí)也可能造成目標(biāo)物的損失[25]。本實(shí)驗(yàn)考察不同體積分?jǐn)?shù)（5%、10%、15%、20%）的甲醇溶液作為淋洗液時(shí)，樣品基質(zhì)去除情況及回收率情況。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，BPA和BPS回收率分別為84%和95%，而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)增至15%時(shí)，BPA回收率下降較多，僅為67%。因此要保證回收率的同時(shí)，最大程度去除基質(zhì)干擾，應(yīng)選擇10%的甲醇溶液為淋洗液。

2.2.3 洗脫液和體積的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，使用C18和HLB小柱萃取BPA和BPS時(shí)，大多采用甲醇和乙腈作為洗脫劑[23,26-29]。因此實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈對(duì)兩種目標(biāo)物的洗脫情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者洗脫效果相當(dāng)，考慮到乙腈沸點(diǎn)高（甲醇沸點(diǎn)64.7 ℃、乙腈沸點(diǎn)81.6 ℃），濃縮時(shí)間長(zhǎng)，因此選擇甲醇為洗脫劑?？疾觳煌w積的甲醇對(duì)兩種化合物的洗脫情況，作出流出曲線（圖5）。由圖5可見(jiàn)，BPA和BPS在洗脫體積為10 mL時(shí)回收率已趨于穩(wěn)定，因此方法最終選擇洗脫劑用量為10 mL。

圖5 BPA和BPS的流出曲線Fig. 5 Elution curves of BPA and BPS

2.3 線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度和檢出限

分別以BPA和BPS峰面積為y軸，化合物質(zhì)量濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。BPA和BPS在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均超過(guò)0.995。將兩種雙酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品添加至超純水中（BPS 2 ng/L、BPA 10 ng/L），按照上述條件進(jìn)行前處理，平行測(cè)定7 份樣品，按照3.143 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差獲得兩種化合物的方法檢出限，與已有報(bào)道相比，本方法檢出限低1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，能夠滿(mǎn)足飲用水中痕量BPA和BPS的分析測(cè)定要求。

表3 BPA和BPS的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限Table 3 Linear equations and LODs for BPA and BPS

表4 BPA和BPS的加標(biāo)回收率和RSD（n= 3）Table 4 Recoveries and RSDs of BPA and BPS (n= 3)

按優(yōu)化的方法進(jìn)行目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在純水中加入低、中、高3 個(gè)水平的BPA和BPS標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)添加水平設(shè)置3 個(gè)平行樣，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD（表4）。結(jié)果表明，BPS和BPA加標(biāo)回收率分別為83.7%～98.2%和88.3%～114.8%，RSD為5.9%～12.3%和10.0%～16.2%。此外，實(shí)驗(yàn)還對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了基體加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（表5），兩種化合物的加標(biāo)回收率分別為80.9%～96.2%和74.8%～118.0%。比較發(fā)現(xiàn)本研究純水和實(shí)際水樣中BPA和BPS的加標(biāo)回收率范圍與已有文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)，表明本方法準(zhǔn)確度較好，適合于飲用水的分析測(cè)定。

表5 BPA和BPS的實(shí)際樣品分析結(jié)果Table 5 Contents of BPA and BPS in drinking water samples

2.4 實(shí)際樣品的分析

采用建立的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)湖北省地市內(nèi)6 個(gè)飲用水源地共12 個(gè)點(diǎn)位的水樣中BPA和BPS進(jìn)行分析，其中5 個(gè)點(diǎn)位有不同程度的BPA檢出（表5），質(zhì)量濃度范圍為2.3～14.8 ng/L，BPS均未檢出，空白樣品和實(shí)際樣品色譜圖見(jiàn)圖6。與已有文獻(xiàn)[29-31]分析比較發(fā)現(xiàn)，本研究飲用水樣中BPA質(zhì)量濃度范圍與已有文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，而飲用水中BPS鮮見(jiàn)有報(bào)道檢出。

圖6 BPA空白樣品（A）和實(shí)際水樣（B）MRM圖Fig. 6 Multi-reaction monitoring chromatograms for BPA in a blank sample (A) and water sample (B)

3 結(jié) 論

本研究采用HLB固相萃取樣品中BPA和BPS，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量，建立了飲用水中痕量BPA和BPS的檢測(cè)方法。利用該方法對(duì)湖北省內(nèi)6 處飲用水源地樣品進(jìn)行BPA和BPS含量測(cè)定，結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)單高效、定性準(zhǔn)確、精密度好、檢出限低，遠(yuǎn)低于GB 5749—2006規(guī)定的BPA限定值0.01 mg/L，滿(mǎn)足飲用水檢測(cè)限量要求。