超高壓激活鮮榨梨汁多酚氧化酶的酶學(xué)特性

尚海濤，宣曉婷，崔 燕，林旭東，俞靜芬，凌建剛*

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，寧波市農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315040）

翠冠梨（Pyrus pyrifolia Nakai cv. Cuiguan）屬砂梨系統(tǒng)，果個(gè)大、果心小、果肉乳白色、肉質(zhì)松脆細(xì)膩、石細(xì)胞少、汁多味甜，是我國(guó)南方地區(qū)的主栽早熟品種。翠冠梨以早熟、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)而廣受生產(chǎn)者和消費(fèi)者喜愛，又稱“六月雪”，是盛夏解渴消暑的時(shí)令佳品。但翠冠梨果實(shí)常溫下不耐貯藏，極易因發(fā)生病害而腐爛[1]。發(fā)展加工業(yè)可以延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈、效益鏈，實(shí)現(xiàn)農(nóng)民多層次多渠道增收。

翠冠梨出汁率高、褐變程度輕、果汁鮮亮，具有良好的感官品質(zhì)，是鮮榨梨汁的理想材料。傳統(tǒng)加工以熱加工為主，用以殺滅腐敗微生物和鈍化酶活力，但熱加工會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)損失[2]。梨汁對(duì)熱極為敏感，易產(chǎn)生后熟味[3]。超高壓（high pressure processing，HPP）非熱加工技術(shù)是指在室溫或溫和加熱條件下利用100～1 000 MPa壓力處理食品，以達(dá)到殺菌、鈍化酶活力和加工食品的目的[4]，而對(duì)于口感、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的影響很小[5]，有助于開發(fā)高品質(zhì)產(chǎn)品，也因此受到極大地關(guān)注。有研究表明超高壓處理果汁具有良好的殺菌效果[6]，但也有研究表明超高壓處理很難完全鈍化酶活力，甚至表現(xiàn)出激活效應(yīng)[7]，加速果汁褐變，限制了超高壓技術(shù)的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)處理前后鮮榨梨汁中溶解氧質(zhì)量濃度、總酚濃度以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）最適pH值、最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性、米氏常數(shù)（Km），研究超高壓處理對(duì)鮮榨梨汁貨架期色澤的影響。超高壓加速褐變機(jī)制的研究在應(yīng)用科學(xué)上為控制酶促褐變提供參考依據(jù)，在理論科學(xué)上有助于探討物理因素引起的酶促褐變機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

翠冠梨于2018年7月20日購(gòu)于寧波市鄞州綠洲果業(yè)專業(yè)合作社。

鄰苯二酚 上海展云化工有限公司；曲拉通X-100（Triton X-100） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲基二碳酸鹽（dimethyl dicarbonate，DMDC） 美國(guó)Sigma公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA） 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CC-600（R）plus原汁機(jī) 圖們惠人電子有限公司；CQC2L-600全液相超高壓設(shè)備 北京速原中天科技股份公司；CR-5色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)株式會(huì)社；UV1600紫外-可見分光光度計(jì) 上海赫爾普國(guó)際貿(mào)易有限公司；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FG4溶解氧測(cè)定儀 瑞士梅特勒-托利多公司；PB-10數(shù)顯pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；SDC-6低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮榨梨汁加工

翠冠梨去皮、去核、去柄后，采用原汁機(jī)榨汁，果汁經(jīng)200 目尼龍紗布過(guò)濾后灌裝，隨機(jī)分為兩組。一組采用超高壓處理（HPP組）；另一組未處理作為對(duì)照（CK組）。

1.3.2 超高壓處理

預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用0、100、200、300、400、500、600 MPa超高壓處理鮮榨梨汁5 min，結(jié)果表明壓力越高，殺菌效果越明顯，400～600 MPa處理梨汁菌落總數(shù)不超過(guò)100 CFU/mL，符合GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》要求。貨架期觀察表明，300～600 MPa處理會(huì)加速梨汁褐變，壓力越高，褐變?cè)皆纭⒃矫黠@。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取500 MPa、5 min作為超高壓處理?xiàng)l件。

1.3.3 待測(cè)樣品預(yù)處理

用于色澤測(cè)定的對(duì)照組再隨機(jī)分為3 組：其中一組添加Triton X-100（最終體積分?jǐn)?shù)1%）（Triton X-100組）；一組添加SDS（最終質(zhì)量濃度2 g/L）（SDS組）；一組不做處理為對(duì)照組（CK組）。這3 組樣品均添加200 mg/L DMDC以防止發(fā)酵對(duì)色澤的影響；雖然超高壓處理可以控制樣品發(fā)酵，但為了保持樣品一致性，也添加相同質(zhì)量濃度的DMDC。超高壓處理后0 h立即測(cè)定樣品pH值、總酚濃度、溶解氧質(zhì)量濃度和菌落總數(shù)。4 組樣品于25 ℃放置，每6 h取樣測(cè)定色澤一次。用于酶學(xué)特性指標(biāo)檢測(cè)的樣品分裝于10 mL離心管中，-80 ℃超低溫冰箱中凍藏，測(cè)定前先冷水浴融解。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 色澤的測(cè)定

色澤參照Gao Ge等的方法[8]，取15 mL樣品于樣品皿內(nèi)，采用色差計(jì)測(cè)定。測(cè)定模式為反射測(cè)量，測(cè)定口徑為30 mm，測(cè)定亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）值。按公式（1）計(jì)算色差值（ΔE）。

式中：L0*、a0*、b0*為初始值；Lt*、at*、bt*為貨架期t時(shí)的測(cè)定值。

1.3.4.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法，培養(yǎng)溫度（36±1）℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

1.3.4.3 總酚濃度的測(cè)定

總酚濃度采用福林-酚法[9]測(cè)定。取1 mL梨汁，加入4 mL蒸餾水，振蕩混勻。12 000×g、4 ℃離心15 min，取1 mL上清液，加1 mL福林-酚試劑、3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%無(wú)水碳酸鈉。50 ℃保溫30 min，測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處吸光度。以鄰苯二酚為底物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.4 溶解氧質(zhì)量濃度和pH值的測(cè)定

溶解氧質(zhì)量濃度采用溶解氧儀測(cè)定。pH值采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.4.5 PPO最適反應(yīng)pH值測(cè)定

參照Liu Fang等[10]的方法，配制0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 5.5）、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5）、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0、pH 8.5）。取3.5 mL梨汁，加3.5 mL緩沖液，振蕩混勻，12 000×g、4 ℃離心15 min，上清液即為所提取的酶液。采用相應(yīng)pH值的緩沖液配制50 mmol/L鄰苯二酚溶液。3 mL反應(yīng)體系中含1.9 mL緩沖液、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液和0.1 mL酶液。測(cè)定4 min內(nèi)A420nm變化，以每分鐘吸光度上升0.1作為一個(gè)酶活力單位（U）。PPO活力按公式（2）計(jì)算。

式中：A0為初始吸光度；A1為放置4 min后吸光度。

1.3.4.6 PPO最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

采用PPO最適反應(yīng)pH值的緩沖液提取酶液。離心管中加入1.9 mL緩沖液、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，測(cè)定前先分別于5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 ℃恒溫槽中放置10 min，然后加入0.1 mL酶液，立即計(jì)時(shí)再放置4 min，然后測(cè)定A420nm。以沸水浴5 min鈍化酶活力的酶液作為空白。PPO活力按公式（2）計(jì)算。

1.3.4.7 PPO熱穩(wěn)定性的測(cè)定

采用PPO最適反應(yīng)pH值的緩沖液提取酶液。然后將酶液置于45、55、65、75、85、95 ℃恒溫槽中，分別水浴10、20、30、40、50、60 min。水浴后用冰水降溫，PPO活力按公式（2）計(jì)算。

1.3.4.8 PPO Km的測(cè)定

采用PPO最適反應(yīng)pH值的緩沖液提取酶液。分別配制濃度為1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375、0.004 687 5、0.002 343 75 mol/L的鄰苯二酚溶液，測(cè)定不同底物濃度下的PPO活力。3 mL反應(yīng)體系中含1 mL鄰苯二酚溶液，因而底物濃度[S]為鄰苯二酚溶液濃度的1/3。根據(jù)不同的底物濃度[S]對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率V，求出兩者的倒數(shù)，參照Lineweaver-Burk作圖法，以1/V為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖。擬合線性方程：y＝ax+b，得出最大反應(yīng)速率（Vmax）＝1/b，米氏常數(shù)Km＝a×Vmax＝a/b。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各指標(biāo)平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件，差異顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯氏多重比較法，差異顯著性水平為0.05。采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)鮮榨梨汁貨架期色澤的影響

如圖1所示，對(duì)照組梨汁褐變緩慢，貨架期24 h時(shí)果汁色澤變化仍不明顯，ΔE僅為0.56，小于人肉眼可識(shí)別的ΔE（1.5）。超高壓處理前后（鮮榨和0 h時(shí)）梨汁色澤的差異不明顯，但超高壓處理加速了貨架期褐變，表現(xiàn)為L(zhǎng)*值快速下降，ΔE快速上升。貨架期6 h時(shí)超高壓處理組ΔE已達(dá)1.61，人肉眼可見明顯的褐變；12 h后色澤的變化趨于緩慢，但仍逐漸上升。Triton X-100因可將膜蛋白從細(xì)胞膜上解離下來(lái)，是目前常用的檢測(cè)結(jié)合態(tài)PPO的方法[10]。從圖1可知，Triton X-100處理后色澤的變化僅略高于對(duì)照組，遠(yuǎn)小于超高壓處理組，可推測(cè)超高壓處理加速梨汁褐變與膜結(jié)合態(tài)的PPO關(guān)系不大。SDS是PPO激活劑之一[11]。從圖1可知，超高壓處理組色澤變化趨勢(shì)與SDS組相似，可推測(cè)超高壓處理激活了PPO，從而加速了褐變。同時(shí)，潛在酶活性是一種不同于膜結(jié)合態(tài)酶活性的新形式，游離態(tài)PPO和膜結(jié)合態(tài)PPO都可能存在潛在酶活性。

圖1 超高壓處理前后鮮榨梨汁貨架期色澤L*值（A）和ΔE（B）的變化Fig. 1 Changes in L* (A) and ΔE (B) of HPP treated and untreated pear juice during shelf life

2.2 超高壓處理對(duì)菌落總數(shù)、溶解氧質(zhì)量濃度、總酚濃度和pH值的影響

表1 超高壓處理對(duì)鮮榨梨汁菌落總數(shù)、溶解氧質(zhì)量濃度、總酚濃度和pH值的影響Table 1 Effect of HPP treatment on total bacterial count, dissolved oxygen conconcentration, total phenol content and pH of fresh pear juice

如表1所示，超高壓處理可以顯著降低菌落總數(shù)，使菌落總數(shù)由2 867 CFU/mL降至28 CFU/mL，殺菌效果顯著，達(dá)到99.0%。梨汁褐變主要是由PPO引起的酶促褐變。PPO是一類含銅的氧化還原酶，在氧氣存在下催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，繼而聚合形成褐色物質(zhì)[12]。發(fā)生酶促褐變的三要素為：酚類底物、PPO和氧氣。如表1所示，超高壓處理后的溶解氧質(zhì)量濃度與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），總酚濃度顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可知，超高壓加速梨汁褐變與溶解氧和酚類底物無(wú)關(guān)。因此，加速褐變的原因只能與PPO有關(guān)。而超高壓處理對(duì)梨汁pH值無(wú)顯著影響，可排除pH值對(duì)PPO活力的影響。

2.3 PPO最適反應(yīng)pH值分析

如圖2所示，超高壓處理后PPO最適反應(yīng)pH值有兩個(gè)，分別為pH 5.0和pH 7.0，分別記為PPO1和PPO2，但處理前最適pH值只有一個(gè)，為pH 5.0，pH 7.0處的峰不明顯。超高壓處理前PPO1活力為6.5 U/mL，處理后為14.1 U/mL，上升了1.17 倍。超高壓處理前PPO2活力為2.6 U/mL，處理后為25.5 U/mL，上升了8.8 倍。由此可見，超高壓處理使低活力甚至無(wú)活力的PPO表現(xiàn)出高催化活性，即產(chǎn)生了激活效應(yīng)。

圖2 pH值對(duì)超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO活力的影響Fig. 2 Effect of pH on PPO activity of HPP treated and untreated pear juice

2.4 PPO最適反應(yīng)溫度分析

圖3 溫度對(duì)超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO1（A）和PPO2（B）活力的影響Fig. 3 Effect of temperature on PPO1 (A) and PPO2 (B) activity of HPP treated and untreated pear juice

如圖3A所示，超高壓處理前后PPO1活力都表現(xiàn)為隨溫度升高先上升后下降的變化趨勢(shì)，超高壓處理前PPO1最適溫度35 ℃，處理后最適溫度為25 ℃。如圖3B所示，超高壓處理前后PPO2活力均表現(xiàn)為隨溫度升高而下降的趨勢(shì)，其在5～25 ℃緩慢下降，25 ℃以后快速下降。最適反應(yīng)溫度為5 ℃，意味著超高壓處理后的梨汁即使冷藏也極易發(fā)生褐變。

2.5 PPO熱穩(wěn)定性分析

如圖4A所示，對(duì)照組45、55 ℃加熱時(shí)PPO1活力變化不大，65 ℃加熱時(shí)其活力緩慢上升，75、85 ℃加熱時(shí)其活力先上升后下降，95 ℃加熱時(shí)其活力快速下降。其中，75 ℃加熱30 min時(shí)PPO1活力最高，為14.25 U/mL，與超高壓處理后的PPO1活力相近（圖2）。由此可見，65、75、85 ℃加熱處理也具有PPO激活效應(yīng)。但隨著溫度提高或者加熱時(shí)間延長(zhǎng)，PPO1活力開始下降，表現(xiàn)為鈍化酶活力效應(yīng)。因此可知，加熱對(duì)鮮榨梨汁PPO1先激活后鈍化，而對(duì)于已被超高壓激活的PPO1，加熱只表現(xiàn)出鈍化酶活力效應(yīng)（圖4C）。Yemenicioglu等[13]在蘋果中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，他們采用3 個(gè)溫度（68、73、78 ℃）加熱處理PPO，發(fā)現(xiàn)其活力先上升后下降，認(rèn)為蘋果PPO存在潛在酶活力。Terefe等[14]研究表明，60～76 ℃熱處理會(huì)導(dǎo)致藍(lán)莓PPO活力上升。超高壓處理前后45～95 ℃加熱對(duì)PPO2只表現(xiàn)出鈍化酶活力效應(yīng)（圖4B、D）；更低的溫度（5～35 ℃）處理只是使其活力下降更慢或者不變，未見PPO2活力上升現(xiàn)象（數(shù)據(jù)未列出）。但不排除一定溫度下長(zhǎng)時(shí)間處理激活PPO2的可能。

圖4 超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO1和PPO2的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermal stability of PPO1 and PPO2 in HPP treated and untreated pear juice

2.6 PPO Km分析

圖5 超高壓處理對(duì)PPO酶促反應(yīng)米氏方程曲線的影響Fig. 5 Effect of HPP treatment on Michaelis-Menten equation curve for PPO in fresh pear juice

如圖5所示，PPO1和PPO2超高壓處理前后的米氏方程曲線比較相似。隨底物濃度的增加，超高壓處理后的PPO酶促反應(yīng)米氏方程曲線上升比超高壓處理前更快。而且超高壓處理后的米氏方程曲線更早出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。

表2 超高壓處理對(duì)PPO酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 2 Effect of HPP treatment on kinetic parameters of PPO in fresh pear juice

如圖5和表2所示，計(jì)算得出超高壓處理前PPO1的Vmax和Km分別為3.058 U和0.425 mol/L，PPO2的Vmax和Km分別為2.874 U和0.351 mol/L；超高壓處理后PPO1的Vmax和Km分別為1.938 U和0.021 mol/L，PPO2的Vmax和Km分別為2.273 U和0.016 mol/L。PPO1 Vmax由3.058 U下降至1.938 U，下降了36.7%；PPO2 Vmax由2.874 U下降至2.273 U，下降了20.9%。

超高壓處理后Vmax和Km都下降。由米氏方程V＝Vmax[S]/（Km+[S]）可知，Vmax下降導(dǎo)致V下降，Km下降導(dǎo)致V上升。PPO激活效應(yīng)主要是由于Km的下降，即酶和底物之間親和力1/Km的上升。PPO1與底物的親和力從2.353 L/mol上升至46.909 L/mol，上升了18.9 倍；PPO2與底物的親和力從2.852 L/mol上升至62.857 L/mol，上升了21.0 倍。由表1可知，鮮榨梨汁中總酚濃度約為0.90 mmol/L，代入米氏方程可知，超高壓處理前后PPO1酶促反應(yīng)速率分別為0.006 46 U和0.078 50 U，PPO2酶促反應(yīng)速率分別為0.007 36 U和0.121 69 U，分別上升了12.2 倍和16.5 倍。超高壓處理后Vmax對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響超過(guò)Km的影響，將會(huì)導(dǎo)致V下降，即產(chǎn)生鈍化效應(yīng)。

3 討 論

3.1 超高壓處理的激活效應(yīng)

超高壓處理（500 MPa、5 min）激活潛在PPO活力，加速鮮榨梨汁褐變。這一激活效應(yīng)早有報(bào)道。曾慶梅等[7]研究表明，處理溫度50 ℃、保壓時(shí)間10 min、pH值為5的條件下，200～300 MPa處理梨汁時(shí)PPO被激活且活力最高，相對(duì)活力分別為115.3%和111.4%。蘇光明等[15]研究表明，較低壓力（100～300 MPa）的超高壓處理對(duì)醬曲PPO有激活作用，200 MPa處理10 min能最大限度地激活醬曲PPO，此時(shí)其相對(duì)活力為135%。趙光遠(yuǎn)等[16]研究表明，400 MPa處理對(duì)PPO有激活作用，VC在500 MPa以下對(duì)梨汁中的PPO有激活作用，400 MPa不加VC和加VC后PPO相對(duì)活力分別為105.6%和119.7%。劉軍偉等[17]研究表明，在溫度30 ℃、保壓時(shí)間10 min的條件下，壓力在100～600 MPa范圍內(nèi)，500 MPa時(shí)紫薯PPO的活力最高，與未經(jīng)超高壓處理PPO活力之比為1.066。本研究結(jié)果表明，超高壓處理后PPO1活力上升了1.17 倍，PPO2活力上升了8.8 倍，遠(yuǎn)超過(guò)以上報(bào)道，與Asaka等[18]的研究結(jié)果較一致，他們研究發(fā)現(xiàn)600 MPa、10 min超高壓處理拉法蘭西梨前后PPO活力分別為1.62、22.40 U/g，活力上升了12.8 倍。Terefe等[14]研究也發(fā)現(xiàn)500 MPa、30 ℃超高壓處理藍(lán)莓可激活PPO，其活力最大可上升6.1 倍。

3.2 超高壓處理的鈍化效應(yīng)

超高壓處理還具有鈍化PPO的效應(yīng)。如曾慶梅等[7]研究表明，處理溫度50 ℃、保壓時(shí)間為10 min，500 MPa處理時(shí)PPO的活力下降到75.3%。趙光遠(yuǎn)等[16]研究表明，500 MPa、60 ℃或750 MPa、50 ℃以上的處理?xiàng)l件可使鮮榨梨汁中的PPO失去60%以上的活力。劉軍偉等[17]研究表明，600 MPa、65 ℃條件下處理35 min后，PPO活力最弱，抑制效果最佳。袁根良等[19]研究表明，壓力480 MPa、溫度55 ℃、保壓時(shí)間10 min，在此條件下，香蕉果肉PPO活力殘存率為0.90%。由于超高壓處理技術(shù)自身存在的一些缺陷，實(shí)踐中單一使用超高壓難以使酶完全鈍化，還需要采用更高的壓力[20]、循環(huán)增壓[21]、協(xié)同中溫或者防褐變劑等技術(shù)。

3.3 PPO激活機(jī)制

PPO激活效應(yīng)的內(nèi)在原因是PPO存在潛在酶活性。潛在酶活性具有兩個(gè)重要的特征：1）以潛在形式存在，本身活性較弱甚至無(wú)活性；2）一定條件下可被激活，激活后表現(xiàn)出高催化活性。現(xiàn)有的研究表明，很多果蔬中存在著潛在酶活性，如杏[22]、枇杷[23]、桃[24]、甜菜根[25]、蘑菇[26]等。本研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理后梨汁PPO最適反應(yīng)pH值有兩個(gè)，分別為pH 5.0和pH 7.0，即以PPO1和PPO2兩種方式存在潛在酶活力。超高壓通過(guò)影響蛋白質(zhì)的分子體積、非共價(jià)鍵等，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改變其活力[27]。劉平等[28]研究認(rèn)為高壓處理改變疏水氨基酸的空間位置與酶活力中心的構(gòu)象有關(guān)，高壓處理后疏水氨基酸的暴露程度越小，酶活力越高。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)超高壓處理更有利于PPO分子與酚類底物接觸，使PPO與底物之間的親和力更高，從而提高了酶促反應(yīng)速率。超高壓是激活PPO潛在酶活性的外在原因之一，除本實(shí)驗(yàn)證實(shí)的潛在酶活性可被SDS處理、熱處理激活外，其還可被Cu2+、脲、胍鹽和限制性蛋白酶解[18]等方式激活。

除了PPO，還有過(guò)氧化物酶、果膠甲酯酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶等25 種酶可被超高壓激活[29]。這些與果蔬生理代謝密切相關(guān)的酶都可能存著潛在酶活形式。不同于化學(xué)和生物因素，壓力和溫度屬于純物理變量，意味著環(huán)境因素可直接作用于果蔬體內(nèi)的酶，進(jìn)而改變果蔬生理代謝途徑。因此，進(jìn)一步研究潛在酶活性及其作用具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用意義。

綜上，超高壓處理鮮榨梨汁存在激活和鈍化兩種效應(yīng)。激活效應(yīng)的內(nèi)在原因是PPO存在潛在酶活性形式，其本身活性較弱甚至無(wú)活性，超高壓處理是激活PPO潛在酶活性的外在原因之一，SDS處理、熱處理等也可激活PPO潛在酶活性。超高壓處理降低PPO的Km，提高其與底物之間的親和力，從而提高酶促反應(yīng)速率，加速鮮榨梨汁褐變。超高壓處理同時(shí)會(huì)降低Vmax，Vmax對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響如超過(guò)Km的影響，將會(huì)表現(xiàn)出鈍化效應(yīng)。