喻梓瑄，張宵敏，周新麗

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

1 引 言

目前，玻璃化法的應(yīng)用范圍主要是卵母細(xì)胞和胚胎的保存，保存過程利用多種形式的冷凍載體，如電鏡銅網(wǎng)法(EMG)[1]，開放式拉伸麥管法(OPS)[2]，半麥管法(Hemi-straw)[3]，Cryotop 法[3]，石英毛細(xì)管法(QMC)[4]，冷凍環(huán)法(Cryoloop)[3]等。有載體的微滴玻璃化，每次僅可對(duì)少量的細(xì)胞進(jìn)行玻璃化保存，且保護(hù)劑的加載去除過程操作復(fù)雜。微滴噴射玻璃化保存，是把含有細(xì)胞的懸液用噴嘴裝置吹打成無序狀態(tài)且十分微小的液滴后,直接噴入液氮中進(jìn)行后續(xù)的玻璃化保存。此方法降溫速率高達(dá)105℃/min，約為普通麥管降溫速率的40倍，可有效實(shí)現(xiàn)玻璃化。Demirci等[5-8]曾提出利用聲學(xué)驅(qū)動(dòng)微機(jī)械噴射裝置產(chǎn)生微滴，該裝置產(chǎn)生的微滴尺寸極小，但細(xì)胞懸浮液濃度過大時(shí)，噴嘴極易堵塞。隨后，Demirci等[9]又提出一種開放式無噴嘴噴射系統(tǒng)，然而該裝置不利于懸浮液的穩(wěn)定噴射。直到Samot等[10]提出一種多噴嘴共流微滴噴射玻璃化保存系統(tǒng)，噴射時(shí)氮?dú)饬髋c細(xì)胞懸浮液形成共流，氮?dú)饬鲗⒓?xì)胞懸浮液離散成微滴并直接噴射至聚乙烯薄片上，薄片用鑷子夾取后放入液氮中進(jìn)行玻璃化。

微滴玻璃化程度與液滴大小密切相關(guān)。Song等[11]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在超快速冷凍時(shí)，當(dāng)微滴體積小于0.1 μL時(shí)，很容易實(shí)現(xiàn)玻璃化。Assal等[12]利用Samot等[10]提出的納升級(jí)噴射微滴玻璃化保存系統(tǒng)應(yīng)用于研究紅細(xì)胞的玻璃化保存,并探究氮?dú)饬魉?、懸浮液注射速度、載體薄膜接收位置三個(gè)參數(shù)對(duì)微滴大小的影響。該研究將噴射、凍結(jié)、復(fù)溫過程的損傷合在一起考慮，并不能看出噴射過程對(duì)細(xì)胞的損傷程度。除以上三個(gè)影響因素外，噴嘴針頭型號(hào)和懸浮液濃度也可能對(duì)微滴大小和細(xì)胞玻璃化效果有較大影響，但未見相關(guān)報(bào)道。

本研究對(duì)氮?dú)饬魉?、懸浮液注射速度、懸浮液濃度、微滴接收位置和針頭型號(hào)等噴射參數(shù)設(shè)計(jì)了單因素試驗(yàn)，研究噴射參數(shù)對(duì)微滴大小的影響；同時(shí)，通過統(tǒng)計(jì)微滴噴射后HepG2細(xì)胞的存活率，分析噴射參數(shù)對(duì)細(xì)胞活性的影響；最后，探究了不同噴射參數(shù)下微滴尺寸與細(xì)胞活性間的關(guān)系，以細(xì)胞活性作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇出最佳的噴射參數(shù)。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

HepG2細(xì)胞,上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清FBS,法國BIOSERA公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基,美國HYCLONE公司；胰酶,美國Sigma公司；D-hanks液,上海勵(lì)瑞生物科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)染色液(2X),上海勵(lì)瑞生物科技有限公司；二甲亞砜(Me2SO),德國APPLICHEM公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱，MCO-18AC，松下醫(yī)療器械有限公司；液氮罐，YDS-50B-125，成都金鳳有限公司；超低溫冰箱，DW-8GL388A，青島海爾特種電器有限公司；光學(xué)顯微鏡，CFI60，尼康。

2.2 微滴噴射裝置介紹

微滴噴射裝置見圖1，主要由氮?dú)饬鬏斔脱b置、細(xì)胞懸浮液注射裝置、噴嘴三部分組成。工作原理為：氮?dú)馄刻峁┑獨(dú)饬?，流量?jì)調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，通過氮?dú)廨敵龉軐⒌獨(dú)廨斔椭羾娮斐诙耍晃⒆⑸浔猛苿?dòng)微注射器，細(xì)胞懸液通過微注射器出口針頭所連接的聚四氟乙烯管輸送至插入噴嘴處的針管。噴嘴由200 μL 的移液器槍頭和 25G/30G 尖口針頭制作而成。

圖1 微滴噴射裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of micro-droplet spray device

圖2為噴嘴制作過程，首先將移液槍槍頭頂端切除2 mm，再取下針頭的不銹鋼針管，最后將針管從距槍頭尖端 2 cm 處側(cè)面插入，直至針管露出槍頭尖端 2 mm，將噴嘴固定于鐵架臺(tái)上。噴出的細(xì)胞用培養(yǎng)皿收集。

圖2 噴嘴制作步驟(a).準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料;(b).拔出針頭;(c).槍頭切去2 mm;(d).針頭側(cè)面插入Fig.2 Step of nozzle fabrication

2.3 微滴噴射單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將HepG2細(xì)胞懸浮于一定濃度的低溫保護(hù)劑中進(jìn)行微滴噴射實(shí)驗(yàn)，研究懸浮液濃度、氮?dú)饬魉佟腋∫鹤⑸渌俣?、接收位置及噴射針頭型號(hào)等五個(gè)因素對(duì)微滴大小和細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)具體參數(shù)如下：氮?dú)饬魉俜謩e為2.4 、3.2、4.0 、4.8 L/min， 噴射針頭為25G, 懸浮液濃度為10%Me2SO，懸浮液注射速度為200 μL/min，接收位置為距噴嘴6 cm處；懸浮液濃度分別為0.5%、10%Me2SO，噴射針頭為25G，氮?dú)饬魉贋?.2 L/min，懸浮液注射速度200 μL/min，接收位置為距噴嘴6 cm處；懸浮液注射速度分別為160、180、200、220 μL/min，噴射針頭為25G, 懸浮液濃度為10%Me2SO，氮?dú)饬魉贋?.2 L/min，接收位置為距噴嘴6 cm處；懸浮液接收位置分別為距噴嘴6、7.5、9 cm處，噴射針頭為25G, 懸浮液濃度為10%Me2SO，氮?dú)饬魉贋?.2 L/min，懸浮液注射速度為200 μL/min；噴射針頭型號(hào)分別為25G、30G，懸浮液濃度10%Me2SO，氮?dú)饬魉贋?.2 L/min，懸浮液注射速度為200 μL/min，接收位置為距噴嘴6 cm處。共五組單因素試驗(yàn)，每組設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn)，噴射的微滴用培養(yǎng)皿接收，每次接收時(shí)間為5 s，接收到的細(xì)胞進(jìn)行顯微拍照，以及細(xì)胞存活率和24 h貼壁率的測(cè)定。

2.4 顯微拍照與圖像處理

將接收到噴射微滴的培養(yǎng)皿迅速放至顯微鏡下拍照，獲取放大40倍的微滴照片，每張照片選取三個(gè)視野。拍攝的照片用Image J處理軟件對(duì)微滴分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 細(xì)胞存活率及24 h貼壁率測(cè)定方法

吸取100 μL重懸的細(xì)胞到離心管內(nèi)，加入100 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液(2X)，混合均勻，染色3 min。再吸取10 μL經(jīng)過染色后的細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藍(lán)色細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。按式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(1)

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用離心管收集上清液，并用2 mL的D-hanks清洗細(xì)胞兩次，離心重懸后死細(xì)胞位于上清液及D-hanks清洗液中，活細(xì)胞都貼壁。貼壁細(xì)胞消化后，裝入離心管中離心重懸。計(jì)數(shù)出活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)觀察細(xì)胞的生長情況和形態(tài)變化。按式(2)計(jì)算細(xì)胞24 h貼壁率。

(2)

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS18.0 對(duì)微滴面積和細(xì)胞活性進(jìn)行t檢驗(yàn)，各處理組間相互比較，P<0.05 即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 氮?dú)饬魉賹?duì)微滴噴射的影響

選用25G針頭作噴嘴，10%Me2SO細(xì)胞懸液，懸浮液注射速度為200 μL/min，接收位置為距噴嘴6 cm處，氮?dú)饬魉俜謩e為2.4、3.2、4.0、4.8 L/min時(shí)，微滴噴射的液滴見圖3。由圖可以看出，隨著氮?dú)饬魉俚脑龃?，微滴尺寸明顯減小，單個(gè)視野內(nèi)微滴數(shù)明顯增多，且微滴均勻性更好。說明氮?dú)饬魉賹?duì)微滴大小具有極其顯著的影響，因此，可通過增加氮?dú)饬魉賮頊p小微滴體積。

表1為不同氮?dú)饬魉傧聡娚涞奈⒌未笮〖凹?xì)胞活性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從表中可以看出，氮?dú)饬魉賹?duì)微滴尺寸有顯著影響，且對(duì)細(xì)胞活性具有顯著影響。當(dāng)其從2.4 L/min增加到3.2 L/min時(shí)，細(xì)胞存活率有所增加；繼續(xù)增大氮?dú)饬魉伲?dāng)?shù)獨(dú)饬魉購?.2 L/min繼續(xù)增至4.8 L/min時(shí)，細(xì)胞活性卻呈下降趨勢(shì)。氮?dú)饬魉贋?.2 L/min時(shí)，細(xì)胞活性達(dá)到(90.17±2.10)%，而氮?dú)饬魉贋?.8 L/min噴射時(shí)，細(xì)胞存活率僅為(70.86±3.76)%。隨著氮?dú)饬魉僭龃?，氮?dú)饬鲗?duì)細(xì)胞的剪切力也隨之加大，容易對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷。當(dāng)設(shè)置氮?dú)饬魉贋?.2 L/min時(shí)，此時(shí)細(xì)胞活性最高，微滴直徑也小于100 μm，可確定為適宜的氮?dú)饬魉佟?/p>

圖3 氮?dú)饬魉賹?duì)微滴大小的影響(a).氮?dú)饬魉?.4 L/min; (b).氮?dú)饬魉?.2 L/min;(c).氮?dú)饬魉?.0 L/min; (d).氮?dú)饬魉?.8 L/minFig.3 Effect of nitrogen flow rate on droplet size表1 氮?dú)饬魉賹?duì)微滴噴射的影響Table 1 Effect of nitrogen flow rate on micro-droplet spray

氮?dú)饬魉?L/min)微滴直徑(μm)細(xì)胞存活率(%)2.4193.45±81.75a80.63±2.44bc3.299.77±19.92b90.17±2.10a4.073.83±17.06c81.40±2.43b4.829.65±8.73d70.86±3.76cd

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 懸浮液濃度對(duì)微滴噴射的影響

表2為不同懸浮液濃度時(shí)，微滴噴射的微滴大小及細(xì)胞活性。由表可知，當(dāng)懸浮液濃度增加時(shí)，懸浮液尺寸明顯減小，細(xì)胞活性略有增加，各組間并不存在顯著性差異。原因是Me2SO存在一定的黏性，在一定范圍內(nèi)，增加懸浮液黏度，可減小產(chǎn)生的微滴尺寸。同時(shí)，細(xì)胞活性無顯著性差異說明懸浮液中Me2SO濃度增加在噴射過程中并未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯滲透損傷。考慮到慢速冷凍HepG2細(xì)胞一般也采用10%Me2SO作為低溫保護(hù)劑，故選用10%Me2SO作為低溫保護(hù)劑加載細(xì)胞。

表2 懸浮液濃度對(duì)微滴噴射的影響Table 2 Effect of suspension concentration on micro-droplet spray

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 懸浮液注射速度對(duì)微滴噴射的影響

表3為不同懸浮液注射速度下，微滴噴射的微滴大小及細(xì)胞活性。從表中數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)懸浮液注射速度由160 μL/min增至200 μL/min時(shí)，微滴體積隨懸浮液注射速度增大而減小，當(dāng)注射速度繼續(xù)增至220 μL/min時(shí)，微滴尺寸有所增大，但各組間沒有顯著差異。但懸浮液注射速度對(duì)細(xì)胞活性卻具有顯著性影響，當(dāng)懸浮液注射速度為200 μL/min時(shí)，此時(shí)細(xì)胞存活率明顯高于其他組。可能是當(dāng)細(xì)胞懸浮液和氮?dú)饬鳂?gòu)成共流時(shí)，將懸浮液注射速度設(shè)置為200 μL/min，氮?dú)饬魉僭O(shè)置為3.2 L/min，二者流速較匹配，此時(shí)產(chǎn)生的微滴尺寸較小，且對(duì)細(xì)胞造成的剪切力損傷最小，故最優(yōu)的懸浮液注射速度可確定為200 μL/min。

表3 懸浮液注射速度對(duì)微滴噴射的影響Table 3 Effect of suspension injection rate on micro-droplet spray

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.4 微滴接收位置對(duì)微滴噴射的影響

表4為距噴嘴不同位置處接收的微滴大小及細(xì)胞活性。從表中數(shù)據(jù)可知，當(dāng)接收距離從6 cm增至9 cm時(shí)，微滴直徑隨著接收距離的增大而減小，細(xì)胞存活率也減小。分析原因可能是隨著接收距離增大，微滴越不容易出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，因此微滴尺寸越小，同時(shí)，接收距離增大，微滴擁有的勢(shì)能增大，轉(zhuǎn)化的動(dòng)能便增大，由此造成的薄片接觸性損傷就越大，因此細(xì)胞活性會(huì)減小。當(dāng)距離噴嘴6 cm處接收微滴時(shí)，此時(shí)得到的細(xì)胞活性最高，考慮到操作的方便性，接收位置不可過分接近噴嘴，故選擇在距噴嘴6 cm處接收細(xì)胞。

表4 接收位置對(duì)微滴噴射的影響Table 4 Effect of receiving position on micro-droplet spray

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.5 針頭型號(hào)對(duì)微滴噴射的影響

表5為選用不同型號(hào)針頭噴射的微滴大小及細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，30G針頭噴射的微滴尺寸明顯較25G噴射的微滴尺寸小，且微滴的均勻性更良好。由表中數(shù)據(jù)可知，采用30G針頭作噴嘴時(shí)，噴射出的微滴尺寸顯著小于25G噴嘴，且細(xì)胞活性顯著高于25G組。說明減小針頭孔徑到30G，并未對(duì)細(xì)胞造成更大的擠壓、剪切損傷。

表5 針頭型號(hào)對(duì)細(xì)胞活性的影響Table 5 Effect of needle type on cell activity

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 總結(jié)與展望

通過單因素實(shí)驗(yàn)研究懸浮液濃度、氮?dú)饬魉?、懸浮液注射速度、微滴接收位置以及噴射針頭的型號(hào)等五個(gè)因素對(duì)微滴大小和細(xì)胞活性的影響。以細(xì)胞活性最高作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，確定最優(yōu)的噴射參數(shù)為：選用30G針頭作噴嘴，10%Me2SO細(xì)胞懸液，氮?dú)饬魉贋?.2 L/min，懸浮液注射速度為200 μL/min，接收位置為距離噴嘴6 cm處。采用此條件噴射的微滴半徑明顯小于100 μm，能夠有效實(shí)現(xiàn)玻璃化。

本研究僅通過微滴噴射培養(yǎng)皿接收后的液滴大小和細(xì)胞存活率，對(duì)微滴噴射參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并未將細(xì)胞噴射入液氮完成完整地玻璃化保存過程，對(duì)于細(xì)胞微滴噴射玻璃化后的效果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。僅以HepG2細(xì)胞為模型進(jìn)行研究，該方法可以作為其他種類小體積細(xì)胞微滴噴射玻璃化保存的參考。另外，該微滴噴射系統(tǒng)如能解決大量收集的問題，即可實(shí)現(xiàn)小體積細(xì)胞高通量保存，滿足臨床應(yīng)用的需求。